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小科研女dow木虫 (小有名气)
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[求助]
构建基因文库的方法筛选到阳性克隆，克隆中插入的基因长为8000bp，如何找到目的基因？ 已有3人参与
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各位虫子们，大家好，小虫今天提出一个长久困扰的问题，希望得到大家的建议，先谢过了~ 最近做基因文库，采用的PUC19作为载体，将不完全酶切的片段插入该载体中后，转化大肠杆菌DH5α，经过筛选得到阳性克隆，将阳性克隆单菌落培养提取质粒后送去测序公司测序，得到一个片段为8000bp的结果，以下为后续工作中遇到的问题： 1、目的基因应该不至于是8000bp这么大，小虫认为实际的目的片段式这8000bp中的一部分，经过软件划分ORF做了几个阅读框的表达，但是均无活性。 2、PUC19不是表达型质粒，所以没有办法将筛选的重组质粒直接转化到Rosetta和BL-21中大量表达，得不到目的蛋白。 3、曾经见过有人对PUC19做过改造，可以用于表达蛋白，而不是仅仅用来克隆，但是自己经验欠缺，没有这方面的基础。 4、还有人说，可以采用可以启动表达的宿主菌，也只是听说，并未接触过。 楼主主要的目的是在这8000bp中寻觅到真正的目的片段，请问有什么好的意见吗？先谢过了!  |
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11楼2014-09-01 00:29:02