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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 微生物gDNA琼脂糖凝胶电泳，问题
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WSXP1104

新虫 (小有名气)

[求助] 微生物gDNA琼脂糖凝胶电泳，问题 已有3人参与

琼脂糖凝胶电泳结果，如附件：
问题：1、样品1出现这中情况，有没有可能是上样量太大？
           2、样品2无条带？
            3、胶出现一半白一半稍黑的现象，是因为制胶时胶槽没有放平？

先谢谢了。

微生物gDNA琼脂糖凝胶电泳，问题
1.PNG
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1楼 2014-08-20 20:51:31
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WSXP1104

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gyesang at 2014-08-21 12:30:06
1. 从你的胶来看，你的胶没有充分凝固好，胶倒完要凝固至少30min，样品1中提取的DNA质量还算可以，一半基因组DNA分子量都比较大，所以会集中在胶的上部，减少上样量，胶可能跑的会更好看
2. 泳道2的确是没有提出DN ...

1,胶凝固30min. 我看过你发的帖子，说胶要薄，这个薄是不超过哦5mm吗？

2、gDNA在23kb左右。上样量：5ul样品+1ul Loading Buffer。样品1微生物数量E+9,样品量2微生物数量在E+2~E+3，洗脱的时候，样品1用了100ul  Buffer AE，样品2则用了50ul。

3、样品1出现这样的情况，是降解了吗？我提取的是肉中微生物的gDNA。样品2泳道出现雾状白色物质，是上样时飘洋？

4、Marker 条带弯弯的，月亮状态，这是？

5、附件是我之前做的，并没有出现一半白一半黑，核酸染料是Goldview I。
微生物gDNA琼脂糖凝胶电泳，问题-1
2.PNG
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8楼2014-08-21 15:18:16
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考拉003

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
WSXP1104: 金币+1 2014-08-21 09:14:09
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-08-21 12:30:40
1,我之前跑胶也会出现这种问题，我也觉得可能是浓度太高了，你这是点了多少样品，太高的话可以点四五微升就够了。
2.没有条带
3.你说胶配完后是一边黑还是？我还没有遇到过，如果你放在扫胶仪中一半变黑的话是因为放置的问题，不要紧。
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不是微生物专业的却进入微生物行业
2楼2014-08-20 21:08:17
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WSXP1104

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 考拉003 at 2014-08-20 21:08:17
1,我之前跑胶也会出现这种问题，我也觉得可能是浓度太高了，你这是点了多少样品，太高的话可以点四五微升就够了。
2.没有条带
3.你说胶配完后是一边黑还是？我还没有遇到过，如果你放在扫胶仪中一半变黑的话是因为 ...

我点了5ul样品，微生物是10的9次方级别，用100ul buffer AE 洗脱DNA。

你一般是用多少去洗脱DNA？
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3楼2014-08-21 09:13:47
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-21 12:30:51
WSXP1104: 金币+1, ★有帮助 2014-08-21 15:25:29
胶出现一半白一半稍黑的现象，是因为制胶时胶加了EB，当你跑胶时，下面的EB就跑出去了，所以最后就没有EB了，这也是为什么跑着跑着那些Marker的小条带很模糊或者消失了的原因。
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4楼2014-08-21 10:29:19
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WSXP1104

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-08-21 10:29:19
胶出现一半白一半稍黑的现象，是因为制胶时胶加了EB，当你跑胶时，下面的EB就跑出去了，所以最后就没有EB了，这也是为什么跑着跑着那些Marker的小条带很模糊或者消失了的原因。

我用的不是EB，我在制胶时加了Goldview I核酸染料。

80V跑了30min.
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5楼2014-08-21 10:37:37
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by WSXP1104 at 2014-08-21 10:37:37
我用的不是EB，我在制胶时加了Goldview I核酸染料。

80V跑了30min....

Goldview I核酸染料也是带电荷的吧？是的话就会移动。
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6楼2014-08-21 11:39:25
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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WSXP1104(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-08-21 15:34:23
WSXP1104: 金币+2, ★有帮助 2014-08-21 15:40:15
1. 从你的胶来看，你的胶没有充分凝固好，胶倒完要凝固至少30min，样品1中提取的DNA质量还算可以，一半基因组DNA分子量都比较大，所以会集中在胶的上部，减少上样量，胶可能跑的会更好看
2. 泳道2的确是没有提出DNA，可能是在提取过程中DNA降解了
3. 胶一半白一半黑，我猜你用的是EB染料，EB带正电，电泳时会向正极移动，所以下面的EB往上跑了就会显得不亮，如果你用的是其他染料，如果染料带电的话，也会出现这种情况
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7楼2014-08-21 12:30:06
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WSXP1104

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 考拉003 at 2014-08-20 21:08:17
1,我之前跑胶也会出现这种问题，我也觉得可能是浓度太高了，你这是点了多少样品，太高的话可以点四五微升就够了。
2.没有条带
3.你说胶配完后是一边黑还是？我还没有遇到过，如果你放在扫胶仪中一半变黑的话是因为 ...

在凝胶成像系统中，就可以看到胶一半偏黑，我这是把胶放中间，把胶移动到偏上的位置，预览就只能看到胶的一部分，怎么弄？
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9楼2014-08-21 15:30:40
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
WSXP1104: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-08-21 17:19:22
引用回帖:
8楼: Originally posted by WSXP1104 at 2014-08-21 15:18:16
1,胶凝固30min. 我看过你发的帖子，说胶要薄，这个薄是不超过哦5mm吗？

2、gDNA在23kb左右。上样量：5ul样品+1ul Loading Buffer。样品1微生物数量E+9,样品量2微生物数量在E+2~E+3，洗脱的时候，样品1用了100ul ...

1. 胶的厚薄根据你的梳子调整，薄胶大概1/3梳齿深，也即梳子的齿1/3插在胶中

2. 样品1，提的还好，gDNA可用，样品2没有提到DNA或者DNA降解

3. 泳道1，不一定是降解，小片段DNA的产生也可能是你在提取过程的机械损伤，这个是避免不了的，样品2前端是降解中的RNA，不是漂样

4. 胶要煮透，然后胶要充分凝固，减少上样量(Marker也是)

5. http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3771137  8楼前西瓜版主的回答
"和EB一样，GoldView电泳时会向负极移动（胶孔方向），所以电泳之后，靠近胶孔那边的背景会更亮，而另一半的胶背景会比较暗，这个是正常现象，不影响结果的。"
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10楼2014-08-21 16:00:49
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