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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体构建一支失败
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你太善良

新虫 (著名写手)

[求助] 载体构建一支失败 已有4人参与

最近构建一条基因的6个载体，已经构建好了5个，另外一个就是PBridge没有构建成功，完全什么都不会张，2个酶切位点隔了4个碱基，尝试了双酶切和分步酶切都不行。还有一个现象就是，PBridge这个载体接种的时候有时间会长而有时间不长，我觉得问题可能出在这里，请大家帮忙分析分析
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1楼 2014-08-13 14:53:56
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zero19871029

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
能把具体情况说清楚点吗，比如空载体能不能切开
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2楼2014-08-13 17:29:49
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Ranen516

金虫 (正式写手)
不太明白！！
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3楼2014-08-13 22:11:16
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peng1997

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-08-20 15:38:46
间隔近 双酶切的时候相互影响 分步的时候，后一个效率不高
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4楼2014-08-14 00:53:21
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你太善良

新虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zero19871029 at 2014-08-13 17:29:49
能把具体情况说清楚点吗，比如空载体能不能切开

单酶切都能切开啊。不能切开还做什么啊
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5楼2014-08-14 08:03:48
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飞奔的大象

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-14 11:06:24
建议将空载测序。或者换一个别人保存的质粒重新转化，抽提，酶切。我以前也遇到过这个问题，或许不是酶切的问题，是你质粒抽提的问题。
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6楼2014-08-14 09:41:21
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小豆子J

铜虫 (初入文坛)
建议转化做个空质粒对照，以确保质粒和感受态细胞没有问题，如果空质粒长斑而连接产物不长，说明质粒酶切开了，问题可能就在于片段没有切开。
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7楼2014-08-14 15:44:06
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zero19871029

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 你太善良 at 2014-08-14 08:03:48
单酶切都能切开啊。不能切开还做什么啊...

我的意思是你既然想要向人求助，就应该把你的操作流程以及遇到的问题写清楚一点，不是撂这一句话说的莫名其妙让人猜是怎么回事
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8楼2014-08-14 17:19:44
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yangnan1987

新虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-20 15:39:00
建议你用一个酶,国产的ClonExpressTMII(价格便宜一些),进口的gibson Assembly®Master Mix(效率高一些),说明书在网上能找到,只要质粒能被线性化,就一定能构建成功,这个酶非常好用.就是质粒不能被线性化,你也可以PCR把质粒扩增出来.
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9楼2014-08-14 21:42:31
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小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-08-20 15:39:09
两个酶切位点只相隔4个碱基，比较危险吧
再就是空载体会不会长呢 不会是抗性弄混了吧
虽然都是小细节 我就经常犯这种错误。。
祝顺利
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生活是一面镜子，要笑着面对！
10楼2014-08-16 20:06:38
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