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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 腺病毒重组技术---重组的质粒怎么丢了？
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81631731

金虫 (小有名气)

[求助] 腺病毒重组技术---重组的质粒怎么丢了？ 已有1人参与

最近做腺病毒重组，频频遇到蹊跷的结果，比如这两天：穿梭质粒筛选没问题，后转BJ5183-AD-1同源重组，鉴定结果也没问题，之后就转XL-10gold大量扩增......问题就出来了，扩增后提质粒，跑胶结果（未经pacI酶切）很奇葩，本来扩增前酶切结果是有23KD和4500bp条带的，没有酶切的话至少比23KD大的，但是结果只看到4500bp的条带，敢问大神可知道重组的质粒哪去了？？？
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要有梦想，即使遥远~
1楼 2014-08-04 18:10:07
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你重新在提纯一次看看吧。可能问题出在扩增上。
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2楼2014-08-05 01:17:37
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81631731

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-08-05 01:17:37
你重新在提纯一次看看吧。可能问题出在扩增上。

恩恩，确实问题出在扩增上，可是就是纳闷扩增环节怎么还会出错，转化了两次都是这样，第一次用的以前的XL-10GOLD，后来又重新做了一批感受态，还是这样，而且同时还做了另一个重组质粒的扩增，提取也是同步的，另外一个都没问题，这个提取的过程中，醋酸钠/乙醇沉淀的时候，看没有絮状沉淀，就怀疑有问题，跑胶果然。。。
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要有梦想，即使遥远~
3楼2014-08-05 14:52:26
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
81631731: 金币+1, 谢谢帮助！~ 2014-08-05 18:01:27
引用回帖:
3楼: Originally posted by 81631731 at 2014-08-05 14:52:26
恩恩，确实问题出在扩增上，可是就是纳闷扩增环节怎么还会出错，转化了两次都是这样，第一次用的以前的XL-10GOLD，后来又重新做了一批感受态，还是这样，而且同时还做了另一个重组质粒的扩增，提取也是同步的，另外 ...

是不是菌出问题了，你用感受态同时转化空质粒和构建成功的质粒，然后提质粒看看怎样的结果
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4楼2014-08-05 15:21:03
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81631731

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sarah-miao at 2014-08-05 15:21:03
是不是菌出问题了，你用感受态同时转化空质粒和构建成功的质粒，然后提质粒看看怎样的结果...

当时同时做了两个重组，其中一个扩增完都没问题，另一个就出现这样的情况。。。所以，没有考虑菌出问题。
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要有梦想，即使遥远~
5楼2014-08-05 17:45:37
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
81631731: 金币+1, 谢谢帮助！~ 2014-08-22 09:18:49
引用回帖:
5楼: Originally posted by 81631731 at 2014-08-05 17:45:37
当时同时做了两个重组，其中一个扩增完都没问题，另一个就出现这样的情况。。。所以，没有考虑菌出问题。...

两个是同样的载体么？载体不同可能在不同的菌中生长情况也不一样的，你那你这个重组的空白质粒试试看看，提质粒有没有，如果没有，那就是加入片段后造成的了
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6楼2014-08-05 19:49:47
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81631731

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by sarah-miao at 2014-08-05 19:49:47
两个是同样的载体么？载体不同可能在不同的菌中生长情况也不一样的，你那你这个重组的空白质粒试试看看，提质粒有没有，如果没有，那就是加入片段后造成的了...

两种载体都是一样的。我把筛选出来的重组质粒pac I酶切了跑胶没问题，就没有扩增了，先这样转293吧。暂时不晓得问题出在哪里。。。今天下午还要提3个扩增的重组质粒，看看情况。
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要有梦想，即使遥远~
7楼2014-08-06 15:30:27
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
81631731: 金币+1, 谢谢帮助！~ 2014-08-22 09:15:05
引用回帖:
7楼: Originally posted by 81631731 at 2014-08-06 15:30:27
两种载体都是一样的。我把筛选出来的重组质粒pac I酶切了跑胶没问题，就没有扩增了，先这样转293吧。暂时不晓得问题出在哪里。。。今天下午还要提3个扩增的重组质粒，看看情况。...

恩恩，先试试看吧，那这样的话可能插入序列的影响比较大了。具体的还真不好讲，生物实验室碰到的事情真是太多了
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8楼2014-08-06 20:52:43
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81631731

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by sarah-miao at 2014-08-06 20:52:43
恩恩，先试试看吧，那这样的话可能插入序列的影响比较大了。具体的还真不好讲，生物实验室碰到的事情真是太多了...

我后来又试着转了一次xl10-gold，这次又成功了，与母液的骨架质粒的电泳结果一样。。。真心不晓得怎么回事。。。操作手法，菌种都一样哎，就是一个扩增。。。
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要有梦想，即使遥远~
9楼2014-08-22 09:16:37
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 81631731 at 2014-08-22 09:16:37
我后来又试着转了一次xl10-gold，这次又成功了，与母液的骨架质粒的电泳结果一样。。。真心不晓得怎么回事。。。操作手法，菌种都一样哎，就是一个扩增。。。...

哎，只能多多交流看看了，有的时候所有的东西都换过一遍也好不了，然后过段时间就自然好了，生物实验室经常出现稀奇古怪的事情的，如果能做的下去实验就别在这个上面纠结了哈
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10楼2014-08-25 08:40:53
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