24小时热门版块排行榜

返回列表

花田馨香

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 2.5
帖子: 11
在线: 5.8小时
虫号: 3327748
注册: 2014-07-17
性别: GG
专业: 植物病理学

[求助] 引物的改特异性不好，请教该怎么修改？急急急！！！！！！！！！！！！！

我现在做的是孺孢类的病害检测，老师给了我ITS ACT GPD EF CAL 的基因片段序列，然后我用MEGA软件比对找出特异性序列，我将这几个片段的平脐蠕孢的序列的进行了比对，发现ITS ACT GPD CAL的差异位点要么不集中，要么差异很小，在EF上找到了玉米小斑（maydis），玉米圆斑(zecola)，高粱叶斑(sorghicola)上有一些特异性片段！然和我就根据这些片段进行了引物设计，目前我的引物能把目的基因的扩增出来，我刚做的时候可能菌株量较少，特异性还可以，但是我加大菌株量，特异性就不好了！我的对照菌株不定，每个菌株都可以作为对照菌株，因为要进行多重比对，不过我主要做的玉米，小麦和高粱上的孺孢的快速检测！
这是一些菌的EF基因：>ZM10587-2 [organism=Bipolaris zeicola]
TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTATGCTATGACTTTTCTTTCACCGGCAGTCCTGCCACTGCCCATTGCAACTTCTGAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCCTTtGCGAACCGCAACACCATGACGCACACTCAATTTTACCTGACGCTGACAACTCTCATAGGAAGCCGCCGAACTCGGTAAGGGTTCCTTCAAGTA

>ZM09327-2 [organism=Bipolaris maydis]
TATGCCTTGACTTTTCTTTCACCAAACCCCCACCACTGTCCATTACAACTTCTGAGCGCGCGCCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCCTTCGCGAACCGCAACACTATGACGCACATGCAATTTCCCACCACCACCACCACCACCACCAACTTCAACGACATCAAGGTCATCCTTGGACATTTAGTCTTTGCGCTTGATAGTCTCTACCTACTAATTGACTGCGCAATGCTGACAAGCCTCACAGGAAGCCGCCGAACTC

>ZM10321 [organism=Bipolaris sorghicola]
TATGCTATGACTTTTCTTTCACCCGCAGCCTTGCCACTGCCCATTGCAACTTCTGAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCTTTCGCGAACCGCAACACTATGACGCACATGCAATTTCCCACTTTTGGCTGCACGATGCTGACAAGCCTCACAGGAAGCCGCCGAACTC

>ZMLC025-2 [organism=Bipolaris sorokiniana]
TATGCCATAAATTTTCTTTCACCTGCAGTCCCGCCACTGCCCGTTGCAACTTTTGAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCCTTCGCGAGCCGCAACACCATGACGCACATACAGTTCCCCACCAACTTCCACGACATCAAGGTCACGCTTGGGCATTTAGTCTCTAAGCTTGATAGTCTCTATTTTTTGATTGCACGATGCTGACAAGCCTCATAGGAAGCCGCCGAACTCGGTAAGGGCCCCTTCAAGTAA

>DH02699 [organism=Bipolaris zeae]
TATGCCATGACTTTTCTTTCACCGGCAGTCCCGCCACTGCCCATTGCAACTTCTAAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGCGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCCTTCGCGAACCGCAACACCATGACGCACATCCAATTCCCCCACCAACTTCCACGACATCAAGGTCACGCTTGGACAGTTTGTCTTTAAGCTT

>ZM09313-2-1 [organism=Bipolaris setariae]
TATGCCATGACTTTTCTTTCACCTACACCCCCGTCACTGTCCATTGCAACTTCTGAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCTTTCGCGAACCGCAACACTATGACGCACATACAATTTCCCACCACCACCACCACCAACTTCAACGACATCAAGGTCATGCTTGGACGTTTAGTCTTTGCGCTT

>ZM10237-2 [organism=Bipolaris sacchari]
TATGCCATGACGTTTCTTTCACCAAACCCCCGCCACTGCCCATTACAACTTCTGAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGGACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCCTTCGCGAACCGCAACACTATGACGCACATGCAATTTCCCACCACCACCACCACCACCACCACCACCAACTTCAACGACATCAAGGTCATGCTTGGACATTTAGTCTTTGCGCTT

>ZM10239-1 [organism=Bipolaris peregianensis]
TATGCTATGACTTTTCTTTCACCCGCAGTCCCGCCACTGCCCATTGCAACTTCTGAGCCCACGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGTATGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCCGGATGCGGCCTTCGCGAACCCCAACACCATGACGCACATACAATTCCCCACCAACGTCCACGACATCAAGGTCACTCTTGGACATTTAGTCTTTGACCTTGATAGTACCTTATCTTTAGCTACACGATGCTGACAAGTCTCACAGGAAGCCGCCGAACTC

>ZM10322-5 [organism=Bipolaris bicolor]
TATGCTATGACTTTTCTTTCATCGGCAGTCCCGACACTGCCCATTGCAACTTCTGAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCTTTCGCGAACCGCAACACCATGACGCACATACAATTCCCCCACCAACCTCCCACAACATCAAGGTCACGCTTGGACAGTTTGTCTTTAAGCTTGGCAGTCTCTTTTCTTTAGCTACACGATGCTGACAAGCCTCATAGGAAGCCGCCGAACTC

我利用MEGA6将上述序列进行比对i，找到了maydis zeicola sorhicola 的特异序列，然后将这些特异性序列利用Pp5和OLIGO7i进行了设计和验证！下面是我比对的结果和相应的引物！
.1.Zecola EF基因的特异性引物
Forward Primer: NewSequence:37F23
5' TATGAGAGTTGTCAGCGTCAGGT 3'
Reverse Primer: NewSequence:221R21
5' GACTTTTCTTTCACCGGCAGT 3'
[Score: 825; Product Length: 205; Opt. T a : 57.7; %GC: 53.7]

2.Sorghicola EF基因的特异性引物
Sequence: NewSequence
(Sense primer) 5' GGCTTGTCAGCATCGTGC 3'

(Anti-sense primer) 5' GGCTTATCGCAATGAGGG 3'

3.Maydis EF基因的特异性引物

Sequence: NewSequence
CCACCACCACCACCAACT 3'

(Anti-sense primer) 5' GGCTTCCTGTGAGGCTTG 3'

我利用自己设计的引物进行了验证，发现自己设计的引物的特异性不好，很多菌都扩出条带了，求高人帮忙修改下我的引物，谢了！

ZNZAJ0S)]XQC7IK(YV6R5X0.jpg