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[求助]
引物的改特异性不好，请教该怎么修改？急急急！！！！！！！！！！！！！
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我现在做的是孺孢类的病害检测，老师给了我ITS ACT GPD EF CAL 的基因片段序列，然后我用MEGA软件比对找出特异性序列，我将这几个片段的平脐蠕孢的序列的进行了比对，发现ITS ACT GPD CAL的差异位点要么不集中，要么差异很小，在EF上找到了玉米小斑（maydis），玉米圆斑(zecola)，高粱叶斑(sorghicola)上有一些特异性片段！然和我就根据这些片段进行了引物设计，目前我的引物能把目的基因的扩增出来，我刚做的时候可能菌株量较少，特异性还可以，但是我加大菌株量，特异性就不好了！我的对照菌株不定，每个菌株都可以作为对照菌株，因为要进行多重比对，不过我主要做的玉米，小麦和高粱上的孺孢的快速检测！ 这是一些菌的EF基因：>ZM10587-2 [organism=Bipolaris zeicola] TCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTATGCTATGACTTTTCTTTCACCGGCAGTCCTGCCACTGCCCATTGCAACTTCTGAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCCTTtGCGAACCGCAACACCATGACGCACACTCAATTTTACCTGACGCTGACAACTCTCATAGGAAGCCGCCGAACTCGGTAAGGGTTCCTTCAAGTA >ZM09327-2 [organism=Bipolaris maydis] TATGCCTTGACTTTTCTTTCACCAAACCCCCACCACTGTCCATTACAACTTCTGAGCGCGCGCCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCCTTCGCGAACCGCAACACTATGACGCACATGCAATTTCCCACCACCACCACCACCACCACCAACTTCAACGACATCAAGGTCATCCTTGGACATTTAGTCTTTGCGCTTGATAGTCTCTACCTACTAATTGACTGCGCAATGCTGACAAGCCTCACAGGAAGCCGCCGAACTC >ZM10321 [organism=Bipolaris sorghicola] TATGCTATGACTTTTCTTTCACCCGCAGCCTTGCCACTGCCCATTGCAACTTCTGAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCTTTCGCGAACCGCAACACTATGACGCACATGCAATTTCCCACTTTTGGCTGCACGATGCTGACAAGCCTCACAGGAAGCCGCCGAACTC >ZMLC025-2 [organism=Bipolaris sorokiniana] TATGCCATAAATTTTCTTTCACCTGCAGTCCCGCCACTGCCCGTTGCAACTTTTGAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCCTTCGCGAGCCGCAACACCATGACGCACATACAGTTCCCCACCAACTTCCACGACATCAAGGTCACGCTTGGGCATTTAGTCTCTAAGCTTGATAGTCTCTATTTTTTGATTGCACGATGCTGACAAGCCTCATAGGAAGCCGCCGAACTCGGTAAGGGCCCCTTCAAGTAA >DH02699 [organism=Bipolaris zeae] TATGCCATGACTTTTCTTTCACCGGCAGTCCCGCCACTGCCCATTGCAACTTCTAAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGCGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCCTTCGCGAACCGCAACACCATGACGCACATCCAATTCCCCCACCAACTTCCACGACATCAAGGTCACGCTTGGACAGTTTGTCTTTAAGCTT >ZM09313-2-1 [organism=Bipolaris setariae] TATGCCATGACTTTTCTTTCACCTACACCCCCGTCACTGTCCATTGCAACTTCTGAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCTTTCGCGAACCGCAACACTATGACGCACATACAATTTCCCACCACCACCACCACCAACTTCAACGACATCAAGGTCATGCTTGGACGTTTAGTCTTTGCGCTT >ZM10237-2 [organism=Bipolaris sacchari] TATGCCATGACGTTTCTTTCACCAAACCCCCGCCACTGCCCATTACAACTTCTGAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGGACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCCTTCGCGAACCGCAACACTATGACGCACATGCAATTTCCCACCACCACCACCACCACCACCACCACCAACTTCAACGACATCAAGGTCATGCTTGGACATTTAGTCTTTGCGCTT >ZM10239-1 [organism=Bipolaris peregianensis] TATGCTATGACTTTTCTTTCACCCGCAGTCCCGCCACTGCCCATTGCAACTTCTGAGCCCACGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGTATGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCCGGATGCGGCCTTCGCGAACCCCAACACCATGACGCACATACAATTCCCCACCAACGTCCACGACATCAAGGTCACTCTTGGACATTTAGTCTTTGACCTTGATAGTACCTTATCTTTAGCTACACGATGCTGACAAGTCTCACAGGAAGCCGCCGAACTC >ZM10322-5 [organism=Bipolaris bicolor] TATGCTATGACTTTTCTTTCATCGGCAGTCCCGACACTGCCCATTGCAACTTCTGAGCGCGCGGCCATTTTCGGGCTTATCGCAATGAGGGGCATTTTTTGGGTGGTGGGGTTGTGCGAACTTTTACGCGCTAGCGCTAGTCTGGATGCGGCTTTCGCGAACCGCAACACCATGACGCACATACAATTCCCCCACCAACCTCCCACAACATCAAGGTCACGCTTGGACAGTTTGTCTTTAAGCTTGGCAGTCTCTTTTCTTTAGCTACACGATGCTGACAAGCCTCATAGGAAGCCGCCGAACTC 我利用MEGA6将上述序列进行比对i，找到了maydis zeicola sorhicola 的特异序列，然后将这些特异性序列利用Pp5和OLIGO7i进行了设计和验证！下面是我比对的结果和相应的引物！ .1.Zecola EF基因的特异性引物 Forward Primer: NewSequence:37F23 5' TATGAGAGTTGTCAGCGTCAGGT 3' Reverse Primer: NewSequence:221R21 5' GACTTTTCTTTCACCGGCAGT 3' [Score: 825; Product Length: 205; Opt. T a : 57.7; %GC: 53.7] 2.Sorghicola EF基因的特异性引物 Sequence: NewSequence (Sense primer) 5' GGCTTGTCAGCATCGTGC 3' (Anti-sense primer) 5' GGCTTATCGCAATGAGGG 3' 3.Maydis EF基因的特异性引物 Sequence: NewSequence CCACCACCACCACCAACT 3' (Anti-sense primer) 5' GGCTTCCTGTGAGGCTTG 3' 我利用自己设计的引物进行了验证，发现自己设计的引物的特异性不好，很多菌都扩出条带了，求高人帮忙修改下我的引物，谢了！  ZNZAJ0S)]XQC7IK(YV6R5X0.jpg   Image16.jpg |
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