| 查看: 3987 | 回复: 10 | |||||
[求助]
包涵体上镍离子柱纯化后，洗脱收集的液体中目的蛋白不见了 已有4人参与
|
|
我的目的蛋白带有his标签，8M尿素溶解包涵体， 纯化时binding buffer:7M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH8.0; Washing buffer:8M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH6.3; Elution buffer:8M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH4.5; 结果洗脱收集的液体中没有目的蛋白，连strip buffer(EDTA)后收集的液体也没有。 怎么回事，纯化之前蛋白电泳检测是存在目的蛋白的，但纯化后竟然没蛋白了。求助各位大神了 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 蛋白质生物学实验经验 | 蛋白表达纯化与检测 |
» 猜你喜欢
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急
已经有5人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急
已经有7人回复
-
售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急
已经有5人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有7人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急
已经有6人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有9人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急
已经有9人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急
已经有11人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- NI 柱纯化重组蛋白无法洗脱是什么原因？
已经有9人回复
- 镍柱纯化His标签蛋白，洗脱不下来
已经有11人回复
- 包涵体蛋白的用透析法的纯化方法
已经有1人回复
- His-tag蛋白纯化柱子洗脱液中除去咪唑的办法
已经有8人回复
- 蛋白过镍柱纯化，在用咪唑洗脱后需要做透析，透析怎么做？？？
已经有15人回复
- 求镍柱子纯化表达蛋白的具体步骤，注意事项！！！
已经有5人回复
- 蛋白纯化时目的蛋白没有洗脱下来
已经有14人回复
- 包涵体蛋白纯化不溶解，怎麽办？
已经有20人回复
- 蛋白纯化-过DEAE阴离子交换柱
已经有7人回复
- 关于镍柱纯化蛋白
已经有10人回复
- 求教离子交换柱纯化蛋白的问题
已经有28人回复
- 包涵体蛋白纯化
已经有1人回复
- 关于带his-tag的膜蛋白镍柱纯化
已经有10人回复
- 求助：纯化蛋白遇到包涵体了，尿素怎么用？
已经有17人回复
- 镍柱纯化蛋白透析出现大量沉淀，请教
已经有18人回复
- 【求助/交流】为什么镍柱纯化可溶性蛋白，电泳结果总是显示不纯呢？
已经有9人回复
- 【求助/交流】镍柱纯化的蛋白保存在-20度一个星期，拿出来都是沉淀？？
已经有19人回复
- 【求助/交流】SP柱子纯化蛋白，蛋白结合后，用2M NacL都没有洗脱下来，该怎么办？
已经有5人回复
- 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
已经有26人回复
2楼2014-07-14 11:02:46
wolfman840
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 2
- 应助: 225 (大学生)
- 金币: 3524.8
- 散金: 20
- 红花: 12
- 帖子: 702
- 在线: 63.2小时
- 虫号: 902627
- 注册: 2009-11-14
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
3楼2014-07-14 16:19:34
4楼2014-07-14 17:06:17
5楼2014-07-14 17:07:41
wolfman840
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 2
- 应助: 225 (大学生)
- 金币: 3524.8
- 散金: 20
- 红花: 12
- 帖子: 702
- 在线: 63.2小时
- 虫号: 902627
- 注册: 2009-11-14
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
6楼2014-07-16 17:05:52
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - BioEPI: 11
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
若确定没有洗脱下来，请依次检查 1.洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强） 解决方法：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。 2.降低PH的方法洗脱的,因为若pH低于3.5,会导致镍离子脱落 解决方法：改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱 3.蛋白已沉淀在柱上 解决方法：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4－8 M脲，或4－6 M 盐酸胍)。 4.可能原因：非特异性疏水或其他相互反应 解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl 的浓度。 以上方法都不灵，那么只能重新设计His尾：1.适当减少His尾中的His残基的数量；2.His尾与蛋白质本体之间构建专一性的酶切位点，比如凝血酶位点，注意：His尾与蛋白质本体之间要留下5-6个亲水的氨基酸片段，以防止引起蛋白质异常折叠和遮盖酶切位点。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
王小七wq7楼2014-07-17 03:58:00
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - BioEPI: 11
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
8楼2014-07-17 03:58:39
9楼2014-07-17 16:47:54
10楼2014-07-17 16:49:32
