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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 包涵体上镍离子柱纯化后，洗脱收集的液体中目的蛋白不见了
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王小七wq

新虫 (初入文坛)

[求助] 包涵体上镍离子柱纯化后，洗脱收集的液体中目的蛋白不见了 已有4人参与

我的目的蛋白带有his标签，8M尿素溶解包涵体，
纯化时binding buffer:7M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH8.0;
Washing buffer:8M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH6.3;
Elution buffer:8M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH4.5;
结果洗脱收集的液体中没有目的蛋白，连strip buffer(EDTA)后收集的液体也没有。
怎么回事，纯化之前蛋白电泳检测是存在目的蛋白的，但纯化后竟然没蛋白了。求助各位大神了
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1楼 2014-07-14 10:08:46
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王小七wq

新虫 (初入文坛)
自己顶一下，还有变性条件纯化时缓冲液里要加咪咗吗
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2楼2014-07-14 11:02:46
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看了你的缓冲液组成，有一个可能是，你使用pH值梯度洗脱，在低pH下你的蛋白是否会失活？或者在等电点时沉淀在柱子上无法洗脱？
不过通常我们做HIS蛋白都采用的是咪唑梯度洗脱，你可以考虑将缓冲液中的尿素换成咪唑，从10mM一直拉梯度到500mM试试。
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3楼2014-07-14 16:19:34
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王小七wq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-07-14 16:19:34
看了你的缓冲液组成，有一个可能是，你使用pH值梯度洗脱，在低pH下你的蛋白是否会失活？或者在等电点时沉淀在柱子上无法洗脱？
不过通常我们做HIS蛋白都采用的是咪唑梯度洗脱，你可以考虑将缓冲液中的尿素换成咪唑 ...

我在纯化手册中查的缓冲液配方，因为我的蛋白是包涵体，所以选的是变性条件的缓冲液。蛋白质应该不会沉淀到柱子上，我用100mM EDTA剥离镍离子，跑胶也没有目的蛋白。
你的意思是只把洗脱液中尿素换成咪唑？还是再加上咪唑，查资料发现有人咪唑和尿素一起洗脱
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4楼2014-07-14 17:06:17
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Allen206

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么要用酸洗？上样前浓度多少？体积多少？有没有page图？无图无真相，不可能消失，洗脱完后用碱洗一下，还没有就用咪唑梯度洗，绝不可能无影无踪，你既然选择了酸洗就不用加咪唑了，下次记得上传图片，祝好
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不想说什么，，，，
5楼2014-07-14 17:07:41
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wolfman840

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王小七wq at 2014-07-14 17:06:17
我在纯化手册中查的缓冲液配方，因为我的蛋白是包涵体，所以选的是变性条件的缓冲液。蛋白质应该不会沉淀到柱子上，我用100mM EDTA剥离镍离子，跑胶也没有目的蛋白。
你的意思是只把洗脱液中尿素换成咪唑？还是再 ...

试试呗，你用EDTA剥了，没见到蛋白，也许意味着酸洗已经下来了。你再做一次全过程样品收集分析，看看情况。我建议用咪唑洗。常用，也比较温和。把尿素的换了试试呗。
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6楼2014-07-16 17:05:52
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
若确定没有洗脱下来，请依次检查

1.洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）
解决方法：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
2.降低PH的方法洗脱的,因为若pH低于3.5,会导致镍离子脱落
解决方法：改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱
3.蛋白已沉淀在柱上
解决方法：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4－8 M脲，或4－6 M 盐酸胍)。
4.可能原因：非特异性疏水或其他相互反应
解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl 的浓度。

以上方法都不灵，那么只能重新设计His尾：1.适当减少His尾中的His残基的数量；2.His尾与蛋白质本体之间构建专一性的酶切位点，比如凝血酶位点，注意：His尾与蛋白质本体之间要留下5-6个亲水的氨基酸片段，以防止引起蛋白质异常折叠和遮盖酶切位点。
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王小七wq
7楼2014-07-17 03:58:00
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

另外就是蛋白质已经被降解了。
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8楼2014-07-17 03:58:39
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王小七wq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-07-16 17:05:52
试试呗，你用EDTA剥了，没见到蛋白，也许意味着酸洗已经下来了。你再做一次全过程样品收集分析，看看情况。我建议用咪唑洗。常用，也比较温和。把尿素的换了试试呗。...

谢谢你的建议。纯化实验新手，所以不太懂，我的蛋白是包涵体，尿素变性，纯化时binding buffer,washing buffer,elution buffer可以不用尿素，只用不同浓度的咪唑吗？
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9楼2014-07-17 16:47:54
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王小七wq

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-17 03:58:00
若确定没有洗脱下来，请依次检查

1.洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）
解决方法：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
2.降低PH的方法洗脱的,因为若pH低于3.5 ...

万分感谢！！！收走备用
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10楼2014-07-17 16:49:32
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