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王小七wq

新虫 (初入文坛)

[求助] 包涵体上镍离子柱纯化后,洗脱收集的液体中目的蛋白不见了 已有4人参与

我的目的蛋白带有his标签,8M尿素溶解包涵体,
纯化时binding buffer:7M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH8.0;
Washing buffer:8M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH6.3;
Elution buffer:8M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH4.5;
结果洗脱收集的液体中没有目的蛋白,连strip buffer(EDTA)后收集的液体也没有。
怎么回事,纯化之前蛋白电泳检测是存在目的蛋白的,但纯化后竟然没蛋白了。求助各位大神了
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
看了你的缓冲液组成,有一个可能是,你使用pH值梯度洗脱,在低pH下你的蛋白是否会失活?或者在等电点时沉淀在柱子上无法洗脱?
不过通常我们做HIS蛋白都采用的是咪唑梯度洗脱,你可以考虑将缓冲液中的尿素换成咪唑,从10mM一直拉梯度到500mM试试。
3楼2014-07-14 16:19:34
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王小七wq

新虫 (初入文坛)

自己顶一下,还有变性条件纯化时缓冲液里要加咪咗吗
2楼2014-07-14 11:02:46
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王小七wq

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-07-14 16:19:34
看了你的缓冲液组成,有一个可能是,你使用pH值梯度洗脱,在低pH下你的蛋白是否会失活?或者在等电点时沉淀在柱子上无法洗脱?
不过通常我们做HIS蛋白都采用的是咪唑梯度洗脱,你可以考虑将缓冲液中的尿素换成咪唑 ...

我在纯化手册中查的缓冲液配方,因为我的蛋白是包涵体,所以选的是变性条件的缓冲液。蛋白质应该不会沉淀到柱子上,我用100mM EDTA剥离镍离子,跑胶也没有目的蛋白。
你的意思是只把洗脱液中尿素换成咪唑?还是再加上咪唑,查资料发现有人咪唑和尿素一起洗脱
4楼2014-07-14 17:06:17
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Allen206

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
为什么要用酸洗?上样前浓度多少?体积多少?有没有page图?无图无真相,不可能消失,洗脱完后用碱洗一下,还没有就用咪唑梯度洗,绝不可能无影无踪,你既然选择了酸洗就不用加咪唑了,下次记得上传图片,祝好
不想说什么,,,,
5楼2014-07-14 17:07:41
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