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包涵体上镍离子柱纯化后，洗脱收集的液体中目的蛋白不见了 已有4人参与
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我的目的蛋白带有his标签，8M尿素溶解包涵体， 纯化时binding buffer:7M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH8.0; Washing buffer:8M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH6.3; Elution buffer:8M Urea,100mM NaH2PO4,100mM Tris ,pH4.5; 结果洗脱收集的液体中没有目的蛋白，连strip buffer(EDTA)后收集的液体也没有。 怎么回事，纯化之前蛋白电泳检测是存在目的蛋白的，但纯化后竟然没蛋白了。求助各位大神了 |
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 蛋白质生物学实验经验 | 蛋白表达纯化与检测 |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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若确定没有洗脱下来，请依次检查 1.洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强） 解决方法：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。 2.降低PH的方法洗脱的,因为若pH低于3.5,会导致镍离子脱落 解决方法：改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱 3.蛋白已沉淀在柱上 解决方法：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4－8 M脲，或4－6 M 盐酸胍)。 4.可能原因：非特异性疏水或其他相互反应 解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加NaCl 的浓度。 以上方法都不灵，那么只能重新设计His尾：1.适当减少His尾中的His残基的数量；2.His尾与蛋白质本体之间构建专一性的酶切位点，比如凝血酶位点，注意：His尾与蛋白质本体之间要留下5-6个亲水的氨基酸片段，以防止引起蛋白质异常折叠和遮盖酶切位点。 |
王小七wq7楼2014-07-17 03:58:00
2楼2014-07-14 11:02:46
wolfman840
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