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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 求助！WB条带不清楚
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zhllhzzhl

铜虫 (小有名气)

[求助] 求助！WB条带不清楚 已有1人参与

小弟做western blot有段时间了， 最近做小鼠DC细胞 A20的干扰，结果western blot不知怎么了， 第一次做的时候能用抗体砸的出来，但后面重复的时候却总是跑得很脏，条带不清。
请教各位大神，不知是否有遇到这样的情况？还请各位不吝赐教！谢谢啦
PS：1.中间变化的条件主要是转膜条件由100A 50mins 换到100v 60mins，有可能因为转过了么？（100A 50mins 最上2条条带没完全转过来）
       2. 由于怀疑是wb中涉及buffer的原因（图2），做过dot plot检验试剂，的确实用的RIPA buffer对抗体有反应， 所以后面用重新配制过，结果还是一样（图三，下面一道为beta-actin，上面模糊的就是我要的条带）
       3. A20大约分子量90kd， 但是砸出来的大概只有80kd，这样应该还正常吧？
       4. 为了得到条带，最近增长曝光时间，结果发现在用A20抗体的时候直接砸出了一条大概30+kd的条带 图4（曝光直接先出来的）
       5. 有可能是蛋白降解么？ 但是如果是蛋白降解 beta-actin条带也还是很清晰；gel也同时跑了平行样，烤蓝对照排除gel的问题

求助！WB条带不清楚
第一次跑的条带


求助！WB条带不清楚-1
图2 后面跑的条带 第一道为loding buffer 第二道为marker


求助！WB条带不清楚-2
图3


求助！WB条带不清楚-3
图4
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1楼 2014-07-01 13:18:59
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biotech_zhou

木虫 (著名写手)

待人以诚：专业/专注/专心

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
youlinglyw: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-07-07 08:53:20
最后出的图说明楼主的实验体系应该没什么问题，转过去的可能性不大，分子量大小无法用marker精确判断，所以你说的大小应该在接受的范围，曝光时间建议缩短，这样可以减少非特异性条带出现，内参含量非常丰富目的蛋白是否降解不可以用内参来判断，建议楼主可重新提取几个蛋白预试。
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2楼2014-07-03 10:02:04
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zhllhzzhl

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biotech_zhou at 2014-07-03 10:02:04
最后出的图说明楼主的实验体系应该没什么问题，转过去的可能性不大，分子量大小无法用marker精确判断，所以你说的大小应该在接受的范围，曝光时间建议缩短，这样可以减少非特异性条带出现，内参含量非常丰富目的蛋白 ...

恩 我再提取次试试，我想可能有些蛋白酶的问题， 十分感谢~
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3楼2014-07-07 08:17:36
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