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zhllhzzhl

铜虫 (小有名气)

[求助] 求助!WB条带不清楚 已有1人参与

小弟做western blot有段时间了, 最近做小鼠DC细胞 A20的干扰,结果western blot不知怎么了, 第一次做的时候能用抗体砸的出来,但后面重复的时候却总是跑得很脏,条带不清。
请教各位大神,不知是否有遇到这样的情况?还请各位不吝赐教!谢谢啦
PS:1.中间变化的条件主要是转膜条件由100A 50mins 换到100v 60mins,有可能因为转过了么?(100A 50mins 最上2条条带没完全转过来)
       2. 由于怀疑是wb中涉及buffer的原因(图2),做过dot plot检验试剂,的确实用的RIPA buffer对抗体有反应, 所以后面用重新配制过,结果还是一样(图三,下面一道为beta-actin,上面模糊的就是我要的条带)
       3. A20大约分子量90kd, 但是砸出来的大概只有80kd,这样应该还正常吧?
       4. 为了得到条带,最近增长曝光时间,结果发现在用A20抗体的时候直接砸出了一条大概30+kd的条带 图4(曝光直接先出来的)
       5. 有可能是蛋白降解么? 但是如果是蛋白降解 beta-actin条带也还是很清晰;gel也同时跑了平行样,烤蓝对照排除gel的问题

求助!WB条带不清楚
第一次跑的条带


求助!WB条带不清楚-1
图2 后面跑的条带 第一道为loding buffer 第二道为marker


求助!WB条带不清楚-2
图3


求助!WB条带不清楚-3
图4
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biotech_zhou

木虫 (著名写手)

待人以诚:专业/专注/专心

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
youlinglyw: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香,生物科学有你更精彩! 2014-07-07 08:53:20
最后出的图说明楼主的实验体系应该没什么问题,转过去的可能性不大,分子量大小无法用marker精确判断,所以你说的大小应该在接受的范围,曝光时间建议缩短,这样可以减少非特异性条带出现,内参含量非常丰富目的蛋白是否降解不可以用内参来判断,建议楼主可重新提取几个蛋白预试。
年末优惠荧光定量pcr、WB、ELISA技术服务一律六折!交流锤炼知识,用心构筑桥梁,以更优质的产品及技术服务助力科研;QQ:2513165427;Email:b
2楼2014-07-03 10:02:04
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zhllhzzhl

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by biotech_zhou at 2014-07-03 10:02:04
最后出的图说明楼主的实验体系应该没什么问题,转过去的可能性不大,分子量大小无法用marker精确判断,所以你说的大小应该在接受的范围,曝光时间建议缩短,这样可以减少非特异性条带出现,内参含量非常丰富目的蛋白 ...

恩 我再提取次试试,我想可能有些蛋白酶的问题, 十分感谢~
3楼2014-07-07 08:17:36
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