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知之为知之a

新虫 (初入文坛)

[求助] 可溶性蛋白在沉淀里面,不在上清液肿么办啊 已有10人参与

做了好几次SDS-PAGE,设计的可溶性蛋白经过细胞破碎后,只发现在下层沉淀里面有表达的诱导蛋白,诱导温度30摄氏度,IPTG浓度0.5mM.时间5个小时。
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知之为知之
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
降低温度到18度,IPTG降低到0.1mM, 过夜诱导试试看?
行至水穷处,坐看云起时
2楼2014-06-18 21:46:46
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普通回帖

anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
低温过夜诱导,在诱导前将对数期的菌液10到15℃预冷半小时试试
爱拼才会赢
3楼2014-06-20 22:27:32
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sqd767019087

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
裂解buffer  ph   诱导温度 诱导od  菌有么有破碎完全

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-06-21 00:18:48
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exon2002

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
两个办法:第一,助溶,改变生产和溶解条件,使原来不溶变成溶;第二,变性蛋白收集,然后复性。
5楼2014-06-21 06:32:45
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duanjifu520

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我觉得应该是溶液环境造成了蛋白的沉淀 你可以试试改变下 例如ph 可以直接在细胞破碎后的混液体中加入微酸或弱碱试试。或者是其中含有某种较高浓度的蛋白沉淀剂 多分析慢慢排除吧

[ 发自小木虫客户端 ]
6楼2014-06-21 13:47:55
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馒头爱生物

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

先低温过夜诱导,降低IPTG浓度,看看能否在上清中表达。
实在不行就采用第二招,溶解包涵体吧
7楼2014-06-23 16:10:59
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bly861

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我觉得很有可能是形成了包涵体,培养温度过高,蛋白大量表达形成包涵体,可以降低培养温度试试,18摄氏度诱导过夜
8楼2014-06-24 15:01:36
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kindlin

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你可以在加入诱导剂前将菌摇至OD=1,加入IPTG后16度过夜诱导试试
9楼2014-06-24 20:31:54
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danchai

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

也可以通过破碎时缓冲液的pH值、盐浓度的变化及变性剂的引入使目的蛋白可溶。
10楼2014-06-25 16:48:22
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