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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药理学 » 肝脏组织中提取的蛋白，20°冷冻后会有沉淀
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foxhuli

木虫 (正式写手)

[交流] 肝脏组织中提取的蛋白，20°冷冻后会有沉淀

很是奇怪，我们之前测别的指标，是肝脏匀浆后，2500转冷冻离心十分钟取上清液，放于20°冰箱保存，第二天就会有些沉淀。为什么会有沉淀，而且转速为什么会对实验有影响呢？转速大了也是不行的。
       如今是跑Western，在匀浆前加含有1MMolPMSF的RIPA裂解液，10000转冷冻离心10min，过两天也会有絮状沉淀。可以跑出内参，但是目的蛋白就是跑不出来。，
      希望有经验的人，可以交流一下！
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1楼 2013-09-07 16:04:08
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weilairuyi

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
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xiaoxiao270: 金币+1 2013-09-08 22:20:36
foxhuli: 金币+3, 谢谢你的意见，很实用 2013-09-09 16:35:54
这种情况我也遇到过，可能是由于1.组织冻存时间有点长，2.在提蛋白过程中肝脏中的脂肪没有除去，3.加入的裂解液少，蛋白有聚集。其实不影响实验结果，但是如果出现沉淀，应该离心取上清后重新蛋白定量，不过要是做组织含量低的蛋白不好做出来。
离心的转速主要是根据需要把破碎的细胞膜，细胞器膜，核膜等沉淀，所以转速主要是看提取哪部分蛋白
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2楼2013-09-08 13:44:06
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foxhuli

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by weilairuyi at 2013-09-08 13:44:06
这种情况我也遇到过，可能是由于1.组织冻存时间有点长，2.在提蛋白过程中肝脏中的脂肪没有除去，3.加入的裂解液少，蛋白有聚集。其实不影响实验结果，但是如果出现沉淀，应该离心取上清后重新蛋白定量，不过要是做组 ...

我很想知道你们是如何把脂肪出去的？我以前是离心后用纱布滤掉的，但是那样上清液就少了。
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3楼2013-09-09 16:37:10
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weilairuyi

新虫 (初入文坛)
★
foxhuli: 金币+1 2013-09-12 17:55:09
引用回帖:
3楼: Originally posted by foxhuli at 2013-09-09 16:37:10
我很想知道你们是如何把脂肪出去的？我以前是离心后用纱布滤掉的，但是那样上清液就少了。...

我们一般都是用那种长的针，就是医院总用的那种骨髓穿刺针抽下面上清，用纱布损失会比较多
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4楼2013-09-09 20:25:09
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宫啾啾

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by weilairuyi at 2013-09-08 13:44:06
这种情况我也遇到过，可能是由于1.组织冻存时间有点长，2.在提蛋白过程中肝脏中的脂肪没有除去，3.加入的裂解液少，蛋白有聚集。其实不影响实验结果，但是如果出现沉淀，应该离心取上清后重新蛋白定量，不过要是做组 ...

您好，您能详细的说一下您怎么提的蛋白吗？裂解液比例是多少？裂解多久？机械匀浆还是研磨的？我遇到了麻烦，ACTIN都跑不出来
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5楼2015-03-30 16:41:47
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宫啾啾

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
您好，请问您现在用肝脏做的western顺利吗？能帮帮我吗？谢谢
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6楼2015-03-30 16:44:16
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