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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 复杂模板，pcr，求指导？？？
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306495799

铁虫 (小有名气)

[求助] 复杂模板，pcr，求指导？？？ 已有5人参与

复杂模板，染色体脆性位点附近，全基因组PCR换了6对对引物p不出来，主要是杂带太多，主带不明显，切胶回收再进行巢式pcr也试了，同一对引物巢式pcr产物切胶回收测序结果也不对，，换更短片段的引物做巢式pcr主带基本看不见了，杂带还是很多，求指导？？？我要扩增产物必须包括360~560大小
http://muchong.com/bbs/post.php?action=newthread&fid=366

>gi|568815591|ref|NC_000007.14|:128207397-128208617 Homo sapiens chromosome 7, GRCh38 Primary Assembly
1        GTGGGAACTG GGTGTACTGA CACTGTGGAA CCAAGGAAGC ACCACGGCTG CAGAGAGACC
61       CTGGGCCAGA CCATCCAAAT GAAGCCCAGG CACAGCAGAG GGCTCTGAGG AGGCGCAGGA
121      TGCAGGAGAT GAAAGGGGAA AATGAAGGGG AGCCGCAGGT TCAAACTGCC CCTTCCCAGG
181      AGTGAGCTAC AGCTTGGCCA CTTCTGTCTC ATAAGAAGGA GGTTGTGACT TTGGGAGGTG
241      GAGGGGGATT ACAGCTGGGA TTCCTGTTGC CTGCCTCCTG CCTCTGGGGC TCTCAGCTTT
301      CTCTTCTCCC CAGGACTCTT TTCTTCCTCT CCCCCCACCT CCCCCCCCAC TCCCCTCCTC
361      CCCCTAGGTC CTGGCTCTCC CTCCCCGACC CGGTCTTCTT GGTACCAGCT AAGCCCTGGA
421      GGGGCCACAG CCTCCCCTCC AGCCCCCCTG CCATGGGATG GCTGCTGTCT CCTTTGGATC
481      TTTTTGCGGT CTGGGCTTGC TGTTCCTCTC AACAGTAGTC AGGAAGCCCT TACCCCAAAA
541      AGTATCTGCG GGAGGCCTTG TCCACAGGGG AGGCTGCCCC AAGGGCTCCA GGTGAGTCAC
601      AGCAAACCCA AGAACAGTGA ATGGAACTGG GGTCTCCTGG CTCTCCTTTA GAGTTGCTGA
661      GTGACTTTAA GTCCAGCACT GAGCCTCTCT GGGCCTCACT TATGCCACTC TTTTCATCAT
721      TTACCAGTGG GCAATGTCAA GTGAGAGACT CCACAGATAA GAAAAATAAA GGAGTGGCTC
781      AATTACATGC CAGGGAAAAC CGCTTTGGTG GATGAAGGTC ACACAGCTCT CCCAGCATTC
841      TGTCCTCTGT ATACAGATGA TCTCCTTCTG AAATCCTTTT GGGGATGACC CCCTTCCACA
901      CCATGGACAC TTCTGGGTGG GTTGTCACTC AAGAGGTCCT GCCCTCTTCT GCCCACTGGG
961      TGGACACAAG AATTGAAATC TGTAAAGGAT ACTGAGATTG GGAACAAAAT AATTGATGCT
1021     GATTGATCCC AGCAGTGTAT GGCGAGAAGA TGACAAGCTT CCACTGCCTG TATCACTGAC
1081     TTGCCTAATG TCTGCCCTGC CCTGGCCTGG ATCTTAACCG CGCCCTTCAT TCTGTGAACT
1141     ACCCCCAAAT CCTTCAAATA AAGTCCTTGA TTGCTTGTTA GAGTCAATAA TATTGCTTGC
1201     TGAGGATCCA GAGACCTCTA G
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也许似乎大概是，然而未必不见得
1楼 2014-06-11 10:26:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
306495799(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-04 08:53:26
对上述几对引物进行特异性分析，特异性好些的是502-F/R和754-F/R，其他几对引物的特异性很差。502-F/R的Tm值为60℃，建议采用降落PCR，从65℃降至55℃，每两个循环降低2℃，最后55℃退火25个循环。754-F/R的Tm值为68℃，建议退火温度设为63℃。若想进一步提高特异性的话，可以在反应体系中加入终浓度为0.5-1 M 甜菜碱提高扩增的特异性。若要求保真性高的话，建议采用Thermo公司的pfu DNA Polymerase，这个酶和降落PCR搭配在一起扩增的效果很好。
复杂模板，pcr，求指导？？？
502F-R.jpg


复杂模板，pcr，求指导？？？-1
754F-R.jpg
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rainwater
15楼2014-06-12 15:44:42
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普通回帖

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-06-11 12:25:15
可以采用好的热启动酶，或采用降落PCR，能很好的减少非特异扩增
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rainwater
2楼2014-06-11 10:37:49
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306495799

铁虫 (小有名气)
我一直用的takara的rtaq，降落pcr循环数怎么控制呢，我之前都是35循环
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也许似乎大概是，然而未必不见得
3楼2014-06-11 10:59:45
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duowan17

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
306495799(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-06-11 12:25:29
全基因组PCR出现大量杂带很正常的，因为你引物的特异性对于整个基因组来说基本不可能太特异。
我的建议是：如果有全基因组的序列，寻找基因组上特有的酶切位点（该酶切位点一定要少，但其中两个位点之间能包括你的基因片段，也可以是多个位点），酶切，回收包含有你目的片段的部分，然后作为模板再进行PCR。
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4楼2014-06-11 11:02:17
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by duowan17 at 2014-06-11 11:02:17
全基因组PCR出现大量杂带很正常的，因为你引物的特异性对于整个基因组来说基本不可能太特异。
我的建议是：如果有全基因组的序列，寻找基因组上特有的酶切位点（该酶切位点一定要少，但其中两个位点之间能包括你的 ...

我后期要大批量验证的，你这个方法也太麻烦了吧，还有，我另外两个位点全基因组pcr结果就很好啊
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也许似乎大概是，然而未必不见得
5楼2014-06-11 13:56:36
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这个片段不大嘛，用什么设计引物，退火多少？退火时间多久，基因组模板PCR要讲究一点哦。

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6楼2014-06-11 14:40:42
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
306495799(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-11 18:53:46
你的基因序列GC含量不低吧。用G Cbuffer试试，而且rTaq太垃圾了，换点好酶试试。
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大家相互帮助哈
7楼2014-06-11 15:04:32
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
306495799(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-11 18:53:55
不妨把你的引物序列传上去，帮你分析一下引物的特异性效果怎样，如果引物特异性很差的话再好的酶也不一定能保证扩出单一的条带。
降落PCR是引物的退火温度最高比Tm 高5℃和最低比Tm值低5℃，每两个循环降低2℃，比如你的引物Tm值是55℃，退火温度从60℃降至50℃，每两个循环将2℃，最后25个循环的退火温度为50℃
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rainwater
8楼2014-06-11 15:42:07
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-11 14:40:42
你这个片段不大嘛，用什么设计引物，退火多少？退火时间多久，基因组模板PCR要讲究一点哦。

我是要包含这两200bp，实际pcr用过754bp，487,474，502,597bp，都不好使，目的条带都不是很亮，而且杂带很多，754bp扩增时，12.5微升体系产物条带挺明显，变成50微升就不行了，而且754bp产物切胶回收再次pcr，同样用754bp条带量，但是切胶回收送测序结果多峰值，给的序列也不对
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也许似乎大概是，然而未必不见得
9楼2014-06-11 17:12:26
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-11 14:40:42
你这个片段不大嘛，用什么设计引物，退火多少？退火时间多久，基因组模板PCR要讲究一点哦。

退火试过55,58,60，时间30s，引物设计有
502-F  ATAAGAAGGAGGTTGTGACTTTGGG
502-R  AAGAGTGGCATAAGTGAGGCCC
595-F  GCCACTTCTGTCTCATAAGAAGGAG
595-R  GGCATGTAATTGAGCCACTCCT
474F-GGCTCTCAGCTTTCTCTTCTC
474R-CTTATCTGTGGAGTCTCTCACTTG
487F-GATTACAGCTGGGATTCCTGT
487R-TGCCCACTGGTAAATGATGAA
754F-CCTGGGCCAG ACCATCCAAA TGAAGC
754R-ATCCACCAAA GCGGTTTTCC CTGGCA
,因为要扩增500bp左右的产物后期酶切验证，754bp稍微好点，但是切胶回收再次pcr送样测序结果不对
复杂模板，pcr，求指导？？？-2
QQ截图20140611174030.jpg


复杂模板，pcr，求指导？？？-3
QQ截图20140611174121.jpg


复杂模板，pcr，求指导？？？-4
QQ截图20140611174150.jpg
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10楼2014-06-11 17:44:05
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