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复杂模板，pcr，求指导？？？ 已有5人参与
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复杂模板，染色体脆性位点附近，全基因组PCR换了6对对引物p不出来，主要是杂带太多，主带不明显，切胶回收再进行巢式pcr也试了，同一对引物巢式pcr产物切胶回收测序结果也不对，，换更短片段的引物做巢式pcr主带基本看不见了，杂带还是很多，求指导？？？我要扩增产物必须包括360~560大小 http://muchong.com/bbs/post.php?action=newthread&fid=366 >gi|568815591|ref|NC_000007.14|:128207397-128208617 Homo sapiens chromosome 7, GRCh38 Primary Assembly 1 GTGGGAACTG GGTGTACTGA CACTGTGGAA CCAAGGAAGC ACCACGGCTG CAGAGAGACC 61 CTGGGCCAGA CCATCCAAAT GAAGCCCAGG CACAGCAGAG GGCTCTGAGG AGGCGCAGGA 121 TGCAGGAGAT GAAAGGGGAA AATGAAGGGG AGCCGCAGGT TCAAACTGCC CCTTCCCAGG 181 AGTGAGCTAC AGCTTGGCCA CTTCTGTCTC ATAAGAAGGA GGTTGTGACT TTGGGAGGTG 241 GAGGGGGATT ACAGCTGGGA TTCCTGTTGC CTGCCTCCTG CCTCTGGGGC TCTCAGCTTT 301 CTCTTCTCCC CAGGACTCTT TTCTTCCTCT CCCCCCACCT CCCCCCCCAC TCCCCTCCTC 361 CCCCTAGGTC CTGGCTCTCC CTCCCCGACC CGGTCTTCTT GGTACCAGCT AAGCCCTGGA 421 GGGGCCACAG CCTCCCCTCC AGCCCCCCTG CCATGGGATG GCTGCTGTCT CCTTTGGATC 481 TTTTTGCGGT CTGGGCTTGC TGTTCCTCTC AACAGTAGTC AGGAAGCCCT TACCCCAAAA 541 AGTATCTGCG GGAGGCCTTG TCCACAGGGG AGGCTGCCCC AAGGGCTCCA GGTGAGTCAC 601 AGCAAACCCA AGAACAGTGA ATGGAACTGG GGTCTCCTGG CTCTCCTTTA GAGTTGCTGA 661 GTGACTTTAA GTCCAGCACT GAGCCTCTCT GGGCCTCACT TATGCCACTC TTTTCATCAT 721 TTACCAGTGG GCAATGTCAA GTGAGAGACT CCACAGATAA GAAAAATAAA GGAGTGGCTC 781 AATTACATGC CAGGGAAAAC CGCTTTGGTG GATGAAGGTC ACACAGCTCT CCCAGCATTC 841 TGTCCTCTGT ATACAGATGA TCTCCTTCTG AAATCCTTTT GGGGATGACC CCCTTCCACA 901 CCATGGACAC TTCTGGGTGG GTTGTCACTC AAGAGGTCCT GCCCTCTTCT GCCCACTGGG 961 TGGACACAAG AATTGAAATC TGTAAAGGAT ACTGAGATTG GGAACAAAAT AATTGATGCT 1021 GATTGATCCC AGCAGTGTAT GGCGAGAAGA TGACAAGCTT CCACTGCCTG TATCACTGAC 1081 TTGCCTAATG TCTGCCCTGC CCTGGCCTGG ATCTTAACCG CGCCCTTCAT TCTGTGAACT 1141 ACCCCCAAAT CCTTCAAATA AAGTCCTTGA TTGCTTGTTA GAGTCAATAA TATTGCTTGC 1201 TGAGGATCCA GAGACCTCTA G |
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【答案】应助回帖
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306495799(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-04 08:53:26
306495799(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-04 08:53:26
对上述几对引物进行特异性分析，特异性好些的是502-F/R和754-F/R，其他几对引物的特异性很差。502-F/R的Tm值为60℃，建议采用降落PCR，从65℃降至55℃，每两个循环降低2℃，最后55℃退火25个循环。754-F/R的Tm值为68℃，建议退火温度设为63℃。若想进一步提高特异性的话，可以在反应体系中加入终浓度为0.5-1 M 甜菜碱提高扩增的特异性。若要求保真性高的话，建议采用Thermo公司的pfu DNA Polymerase，这个酶和降落PCR搭配在一起扩增的效果很好。 502F-R.jpg  754F-R.jpg |
15楼2014-06-12 15:44:42
zhangyunjing
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zhangyunjing
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8楼2014-06-11 15:42:07
9楼2014-06-11 17:12:26
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退火试过55,58,60，时间30s，引物设计有 502-F ATAAGAAGGAGGTTGTGACTTTGGG 502-R AAGAGTGGCATAAGTGAGGCCC 595-F GCCACTTCTGTCTCATAAGAAGGAG 595-R GGCATGTAATTGAGCCACTCCT 474F-GGCTCTCAGCTTTCTCTTCTC 474R-CTTATCTGTGGAGTCTCTCACTTG 487F-GATTACAGCTGGGATTCCTGT 487R-TGCCCACTGGTAAATGATGAA 754F-CCTGGGCCAG ACCATCCAAA TGAAGC 754R-ATCCACCAAA GCGGTTTTCC CTGGCA ,因为要扩增500bp左右的产物后期酶切验证，754bp稍微好点，但是切胶回收再次pcr送样测序结果不对  QQ截图20140611174030.jpg  QQ截图20140611174121.jpg  QQ截图20140611174150.jpg |
10楼2014-06-11 17:44:05
