应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 复杂模板，pcr，求指导？？？
192/2返回列表上一页12
查看: 2406  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-11 15:04:32
你的基因序列GC含量不低吧。用G Cbuffer试试，而且rTaq太垃圾了，换点好酶试试。

GC含量没多少啊，这个片段整个54%而已
赞一下 回复此楼
也许似乎大概是，然而未必不见得
11楼2014-06-11 17:46:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-06-11 15:42:07
不妨把你的引物序列传上去，帮你分析一下引物的特异性效果怎样，如果引物特异性很差的话再好的酶也不一定能保证扩出单一的条带。
降落PCR是引物的退火温度最高比Tm 高5℃和最低比Tm值低5℃，每两个循环降低2℃，比 ...

退火试过55,58,60，时间30s，引物设计有
502-F  ATAAGAAGGAGGTTGTGACTTTGGG
502-R  AAGAGTGGCATAAGTGAGGCCC
595-F  GCCACTTCTGTCTCATAAGAAGGAG
595-R  GGCATGTAATTGAGCCACTCCT
474F-GGCTCTCAGCTTTCTCTTCTC
474R-CTTATCTGTGGAGTCTCTCACTTG
487F-GATTACAGCTGGGATTCCTGT
487R-TGCCCACTGGTAAATGATGAA
754F-CCTGGGCCAG ACCATCCAAA TGAAGC
754R-ATCCACCAAA GCGGTTTTCC CTGGCA
,因为要扩增500bp左右的产物后期酶切验证，754bp稍微好点，但是切胶回收再次pcr送样测序结果不对
赞一下 回复此楼
也许似乎大概是，然而未必不见得
12楼2014-06-11 17:47:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 306495799 at 2014-06-11 17:12:26
我是要包含这两200bp，实际pcr用过754bp，487,474，502,597bp，都不好使，目的条带都不是很亮，而且杂带很多，754bp扩增时，12.5微升体系产物条带挺明显，变成50微升就不行了，而且754bp产物切胶回收再次pcr，同样 ...

你二次扩增，出现这样的结果很正常的

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
13楼2014-06-11 18:06:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-06-11 15:42:07
不妨把你的引物序列传上去，帮你分析一下引物的特异性效果怎样，如果引物特异性很差的话再好的酶也不一定能保证扩出单一的条带。
降落PCR是引物的退火温度最高比Tm 高5℃和最低比Tm值低5℃，每两个循环降低2℃，比 ...

能否帮设计两队好点的引物，之前的引物
502-F  ATAAGAAGGAGGTTGTGACTTTGGG
502-R  AAGAGTGGCATAAGTGAGGCCC
595-F  GCCACTTCTGTCTCATAAGAAGGAG
595-R  GGCATGTAATTGAGCCACTCCT
474F-GGCTCTCAGCTTTCTCTTCTC
474R-CTTATCTGTGGAGTCTCTCACTTG
487F-GATTACAGCTGGGATTCCTGT
487R-TGCCCACTGGTAAATGATGAA
754F-CCTGGGCCAG ACCATCCAAA TGAAGC
754R-ATCCACCAAA GCGGTTTTCC CTGGCA
只有754bp的好使一点，但是切胶回收测序不对，多峰值，给的序列对不上，blast和别的染色体序列相似
赞一下 回复此楼
也许似乎大概是，然而未必不见得
14楼2014-06-11 18:11:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
306495799(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-04 08:53:26
对上述几对引物进行特异性分析，特异性好些的是502-F/R和754-F/R，其他几对引物的特异性很差。502-F/R的Tm值为60℃，建议采用降落PCR，从65℃降至55℃，每两个循环降低2℃，最后55℃退火25个循环。754-F/R的Tm值为68℃，建议退火温度设为63℃。若想进一步提高特异性的话，可以在反应体系中加入终浓度为0.5-1 M 甜菜碱提高扩增的特异性。若要求保真性高的话，建议采用Thermo公司的pfu DNA Polymerase，这个酶和降落PCR搭配在一起扩增的效果很好。
复杂模板，pcr，求指导？？？
502F-R.jpg


复杂模板，pcr，求指导？？？-1
754F-R.jpg
赞一下(1人) 回复此楼
rainwater
15楼2014-06-12 15:44:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

愚者517

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
306495799(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-04 08:53:53
1.首先引物必须符合设计原则，引物需与模板特异性结合。
2.你的模板很长，需要调节退火温度。
3.提高琼脂糖凝胶的浓度，由0.8%提高到1%.
赞一下 回复此楼
16楼2014-06-12 15:54:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-06-12 15:44:42
对上述几对引物进行特异性分析，特异性好些的是502-F/R和754-F/R，其他几对引物的特异性很差。502-F/R的Tm值为60℃，建议采用降落PCR，从65℃降至55℃，每两个循环降低2℃，最后55℃退火25个循环。754-F/R的Tm值为6 ...

我做的降落pcr，从70降到55，0.5一个循环，后来又55退火30循环，延伸都是72度1min，但是最初两次pcr、结果很好，测序是目的条带且单一，但是酶用完，从新拿新的酶又不行了，完全一样的pcr程序啊，后来又55退火同样基因组pcr另一个片段没问题，这个就再也没p出过
复杂模板，pcr，求指导？？？-2
普通pcr，754bp的p不出来，另一个基因位置574没问题.jpg


复杂模板，pcr，求指导？？？-3
重复没p出来.jpg


复杂模板，pcr，求指导？？？-4
最初降落pcr抛出条带，切胶回收，测序正确.jpg
赞一下 回复此楼
也许似乎大概是，然而未必不见得
17楼2014-07-03 22:29:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-06-11 10:37:49
可以采用好的热启动酶，或采用降落PCR，能很好的减少非特异扩增

我做的降落pcr，从70降到55，0.5一个循环，后来又55退火30循环，延伸都是72度1min，但是最初两次pcr、结果很好，测序是目的条带且单一，但是酶用完，从新拿新的酶又不行了，完全一样的pcr程序啊，后来又55退火同样基因组pcr另一个片段没问题，这个就再也没p出过
复杂模板，pcr，求指导？？？-5
普通pcr，754bp的p不出来，另一个基因位置574没问题.jpg


复杂模板，pcr，求指导？？？-6
重复没p出来.jpg


复杂模板，pcr，求指导？？？-7
最初降落pcr抛出条带，切胶回收，测序正确.jpg
赞一下 回复此楼
也许似乎大概是，然而未必不见得
18楼2014-07-03 22:31:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
306495799(gyesang代发): 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 10:50:06
你是用的TaKara的酶吗？既然你的另外一个位置的基因片段能扩增出来，说明模板没有问题，换新的酶，同样的程序，可能的原因有以下几个：
1. 引物的质量是否有保证，反复冻融多次引物的效果不会像以前那么好；
2. 不同批次的酶存在一定差异，你的另外一个位置的基因比较容易扩增出来，但是745 bp的基因比较难扩出来，不同批次的酶的效果有少许的差别，也能导致扩增出不来。
建议解决方法：
1. 重新从100 uM的引物稀释至10 uM，用于PCR
2. 再重新拆一支酶试试，配体系时一定要要认真。
赞一下 回复此楼
rainwater
19楼2014-07-04 10:58:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 306495799 的主题更新
192/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 284求调剂 +8 天下熯 2026-02-28 8/400 2026-03-02 00:15 by 暮雨星晴
[考研] 0854复试调剂 276 +3 wmm9 2026-03-01 3/150 2026-03-01 23:13 by 热情沙漠
[硕博家园] 博士自荐 +7 科研狗111 2026-02-26 11/550 2026-03-01 22:24 by 哲平L
[考研] 材料类求调剂 +10 wana_kiko 2026-02-28 12/600 2026-03-01 22:10 by 海嵙Y
[考研] 274求调剂 +3 cgyzqwn 2026-03-01 6/300 2026-03-01 21:24 by cgyzqwn
[考研] 0805总分292，求调剂 +7 幻想之殇 2026-03-01 7/350 2026-03-01 21:22 by 公瑾逍遥
[考研] 一志愿中南大学理学化学 +4 15779376950 2026-03-01 5/250 2026-03-01 19:00 by Fff-1
[考研] 0856材料求调剂 +11 hyf hyf hyf 2026-02-28 12/600 2026-03-01 18:57 by 18137688336
[考研] 295求调剂 +7 19171856320 2026-02-28 7/350 2026-03-01 18:54 by 18137688336
[考博] 26申博 +4 想申博！ 2026-02-26 6/300 2026-03-01 17:32 by 想申博！
[考研] 281求调剂 +4 2026计算机_诚心 2026-03-01 7/350 2026-03-01 17:20 by 2026计算机_诚心
[考研] 311求调剂 +6 亭亭亭01 2026-03-01 6/300 2026-03-01 15:41 by 324616
[考研] 303求调剂 +4 今夏不夏 2026-03-01 4/200 2026-03-01 14:46 by 嘟嘟小浣熊
[考研] 302材料工程求调剂 +4 Doleres 2026-03-01 5/250 2026-03-01 11:52 by liqiongjy
[考研] 调剂 +3 简木ChuFront 2026-02-28 3/150 2026-03-01 11:46 by 王伟要上岸啊
[考研] 317一志愿华南理工电气工程求调剂 +6 Soliloquy_Q 2026-02-28 11/550 2026-03-01 11:14 by 歌liekkas
[考博] 博士自荐 +4 kkluvs 2026-02-28 4/200 2026-03-01 10:19 by 馥安馥安
[考研] 307求调剂 +4 73372112 2026-02-28 6/300 2026-03-01 00:04 by ll247
[考研] 264求调剂 +3 巴拉巴拉根556 2026-02-28 3/150 2026-02-28 21:31 by gaoxiaoniuma
[硕博家园] 【博士招生】太原理工大学2026化工博士 +4 N1ce_try 2026-02-24 8/400 2026-02-26 08:40 by N1ce_try
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭