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306495799

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-11 15:04:32
你的基因序列GC含量不低吧。用G Cbuffer试试,而且rTaq太垃圾了,换点好酶试试。

GC含量没多少啊,这个片段整个54%而已
也许似乎大概是,然而未必不见得
11楼2014-06-11 17:46:29
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306495799

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-06-11 15:42:07
不妨把你的引物序列传上去,帮你分析一下引物的特异性效果怎样,如果引物特异性很差的话再好的酶也不一定能保证扩出单一的条带。
降落PCR是引物的退火温度最高比Tm 高5℃和最低比Tm值低5℃,每两个循环降低2℃,比 ...

退火试过55,58,60,时间30s,引物设计有
502-F  ATAAGAAGGAGGTTGTGACTTTGGG
502-R  AAGAGTGGCATAAGTGAGGCCC
595-F  GCCACTTCTGTCTCATAAGAAGGAG
595-R  GGCATGTAATTGAGCCACTCCT
474F-GGCTCTCAGCTTTCTCTTCTC
474R-CTTATCTGTGGAGTCTCTCACTTG
487F-GATTACAGCTGGGATTCCTGT
487R-TGCCCACTGGTAAATGATGAA
754F-CCTGGGCCAG ACCATCCAAA TGAAGC
754R-ATCCACCAAA GCGGTTTTCC CTGGCA
,因为要扩增500bp左右的产物后期酶切验证,754bp稍微好点,但是切胶回收再次pcr送样测序结果不对
也许似乎大概是,然而未必不见得
12楼2014-06-11 17:47:10
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 306495799 at 2014-06-11 17:12:26
我是要包含这两200bp,实际pcr用过754bp,487,474,502,597bp,都不好使,目的条带都不是很亮,而且杂带很多,754bp扩增时,12.5微升体系产物条带挺明显,变成50微升就不行了,而且754bp产物切胶回收再次pcr,同样 ...

你二次扩增,出现这样的结果很正常的

[ 发自小木虫客户端 ]
13楼2014-06-11 18:06:45
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306495799

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-06-11 15:42:07
不妨把你的引物序列传上去,帮你分析一下引物的特异性效果怎样,如果引物特异性很差的话再好的酶也不一定能保证扩出单一的条带。
降落PCR是引物的退火温度最高比Tm 高5℃和最低比Tm值低5℃,每两个循环降低2℃,比 ...

能否帮设计两队好点的引物,之前的引物
502-F  ATAAGAAGGAGGTTGTGACTTTGGG
502-R  AAGAGTGGCATAAGTGAGGCCC
595-F  GCCACTTCTGTCTCATAAGAAGGAG
595-R  GGCATGTAATTGAGCCACTCCT
474F-GGCTCTCAGCTTTCTCTTCTC
474R-CTTATCTGTGGAGTCTCTCACTTG
487F-GATTACAGCTGGGATTCCTGT
487R-TGCCCACTGGTAAATGATGAA
754F-CCTGGGCCAG ACCATCCAAA TGAAGC
754R-ATCCACCAAA GCGGTTTTCC CTGGCA
只有754bp的好使一点,但是切胶回收测序不对,多峰值,给的序列对不上,blast和别的染色体序列相似
也许似乎大概是,然而未必不见得
14楼2014-06-11 18:11:35
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
306495799(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-04 08:53:26
对上述几对引物进行特异性分析,特异性好些的是502-F/R和754-F/R,其他几对引物的特异性很差。502-F/R的Tm值为60℃,建议采用降落PCR,从65℃降至55℃,每两个循环降低2℃,最后55℃退火25个循环。754-F/R的Tm值为68℃,建议退火温度设为63℃。若想进一步提高特异性的话,可以在反应体系中加入终浓度为0.5-1 M 甜菜碱提高扩增的特异性。若要求保真性高的话,建议采用Thermo公司的pfu DNA Polymerase,这个酶和降落PCR搭配在一起扩增的效果很好。
复杂模板,pcr,求指导???
502F-R.jpg


复杂模板,pcr,求指导???-1
754F-R.jpg

rainwater
15楼2014-06-12 15:44:42
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愚者517

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
306495799(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-04 08:53:53
1.首先引物必须符合设计原则,引物需与模板特异性结合。
2.你的模板很长,需要调节退火温度。
3.提高琼脂糖凝胶的浓度,由0.8%提高到1%.
16楼2014-06-12 15:54:59
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306495799

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-06-12 15:44:42
对上述几对引物进行特异性分析,特异性好些的是502-F/R和754-F/R,其他几对引物的特异性很差。502-F/R的Tm值为60℃,建议采用降落PCR,从65℃降至55℃,每两个循环降低2℃,最后55℃退火25个循环。754-F/R的Tm值为6 ...

我做的降落pcr,从70降到55,0.5一个循环,后来又55退火30循环,延伸都是72度1min,但是最初两次pcr、结果很好,测序是目的条带且单一,但是酶用完,从新拿新的酶又不行了,完全一样的pcr程序啊,后来又55退火同样基因组pcr另一个片段没问题,这个就再也没p出过
复杂模板,pcr,求指导???-2
普通pcr,754bp的p不出来,另一个基因位置574没问题.jpg


复杂模板,pcr,求指导???-3
重复没p出来.jpg


复杂模板,pcr,求指导???-4
最初降落pcr抛出条带,切胶回收,测序正确.jpg

也许似乎大概是,然而未必不见得
17楼2014-07-03 22:29:12
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306495799

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-06-11 10:37:49
可以采用好的热启动酶,或采用降落PCR,能很好的减少非特异扩增

我做的降落pcr,从70降到55,0.5一个循环,后来又55退火30循环,延伸都是72度1min,但是最初两次pcr、结果很好,测序是目的条带且单一,但是酶用完,从新拿新的酶又不行了,完全一样的pcr程序啊,后来又55退火同样基因组pcr另一个片段没问题,这个就再也没p出过
复杂模板,pcr,求指导???-5
普通pcr,754bp的p不出来,另一个基因位置574没问题.jpg


复杂模板,pcr,求指导???-6
重复没p出来.jpg


复杂模板,pcr,求指导???-7
最初降落pcr抛出条带,切胶回收,测序正确.jpg

也许似乎大概是,然而未必不见得
18楼2014-07-03 22:31:52
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
306495799(gyesang代发): 金币+5, 鼓励回帖交流! 2014-07-16 10:50:06
你是用的TaKara的酶吗?既然你的另外一个位置的基因片段能扩增出来,说明模板没有问题,换新的酶,同样的程序,可能的原因有以下几个:
1. 引物的质量是否有保证,反复冻融多次引物的效果不会像以前那么好;
2. 不同批次的酶存在一定差异,你的另外一个位置的基因比较容易扩增出来,但是745 bp的基因比较难扩出来,不同批次的酶的效果有少许的差别,也能导致扩增出不来。
建议解决方法:
1. 重新从100 uM的引物稀释至10 uM,用于PCR
2. 再重新拆一支酶试试,配体系时一定要要认真。
rainwater
19楼2014-07-04 10:58:27
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