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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 复杂模板，pcr，求指导？？？
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-11 15:04:32
你的基因序列GC含量不低吧。用G Cbuffer试试，而且rTaq太垃圾了，换点好酶试试。

GC含量没多少啊，这个片段整个54%而已
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也许似乎大概是，然而未必不见得
11楼2014-06-11 17:46:29
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-06-11 15:42:07
不妨把你的引物序列传上去，帮你分析一下引物的特异性效果怎样，如果引物特异性很差的话再好的酶也不一定能保证扩出单一的条带。
降落PCR是引物的退火温度最高比Tm 高5℃和最低比Tm值低5℃，每两个循环降低2℃，比 ...

退火试过55,58,60，时间30s，引物设计有
502-F  ATAAGAAGGAGGTTGTGACTTTGGG
502-R  AAGAGTGGCATAAGTGAGGCCC
595-F  GCCACTTCTGTCTCATAAGAAGGAG
595-R  GGCATGTAATTGAGCCACTCCT
474F-GGCTCTCAGCTTTCTCTTCTC
474R-CTTATCTGTGGAGTCTCTCACTTG
487F-GATTACAGCTGGGATTCCTGT
487R-TGCCCACTGGTAAATGATGAA
754F-CCTGGGCCAG ACCATCCAAA TGAAGC
754R-ATCCACCAAA GCGGTTTTCC CTGGCA
,因为要扩增500bp左右的产物后期酶切验证，754bp稍微好点，但是切胶回收再次pcr送样测序结果不对
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也许似乎大概是，然而未必不见得
12楼2014-06-11 17:47:10
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 306495799 at 2014-06-11 17:12:26
我是要包含这两200bp，实际pcr用过754bp，487,474，502,597bp，都不好使，目的条带都不是很亮，而且杂带很多，754bp扩增时，12.5微升体系产物条带挺明显，变成50微升就不行了，而且754bp产物切胶回收再次pcr，同样 ...

你二次扩增，出现这样的结果很正常的

[ 发自小木虫客户端 ]
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13楼2014-06-11 18:06:45
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-06-11 15:42:07
不妨把你的引物序列传上去，帮你分析一下引物的特异性效果怎样，如果引物特异性很差的话再好的酶也不一定能保证扩出单一的条带。
降落PCR是引物的退火温度最高比Tm 高5℃和最低比Tm值低5℃，每两个循环降低2℃，比 ...

能否帮设计两队好点的引物，之前的引物
502-F  ATAAGAAGGAGGTTGTGACTTTGGG
502-R  AAGAGTGGCATAAGTGAGGCCC
595-F  GCCACTTCTGTCTCATAAGAAGGAG
595-R  GGCATGTAATTGAGCCACTCCT
474F-GGCTCTCAGCTTTCTCTTCTC
474R-CTTATCTGTGGAGTCTCTCACTTG
487F-GATTACAGCTGGGATTCCTGT
487R-TGCCCACTGGTAAATGATGAA
754F-CCTGGGCCAG ACCATCCAAA TGAAGC
754R-ATCCACCAAA GCGGTTTTCC CTGGCA
只有754bp的好使一点，但是切胶回收测序不对，多峰值，给的序列对不上，blast和别的染色体序列相似
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也许似乎大概是，然而未必不见得
14楼2014-06-11 18:11:35
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
306495799(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-04 08:53:26
对上述几对引物进行特异性分析，特异性好些的是502-F/R和754-F/R，其他几对引物的特异性很差。502-F/R的Tm值为60℃，建议采用降落PCR，从65℃降至55℃，每两个循环降低2℃，最后55℃退火25个循环。754-F/R的Tm值为68℃，建议退火温度设为63℃。若想进一步提高特异性的话，可以在反应体系中加入终浓度为0.5-1 M 甜菜碱提高扩增的特异性。若要求保真性高的话，建议采用Thermo公司的pfu DNA Polymerase，这个酶和降落PCR搭配在一起扩增的效果很好。
复杂模板，pcr，求指导？？？
502F-R.jpg


复杂模板，pcr，求指导？？？-1
754F-R.jpg
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rainwater
15楼2014-06-12 15:44:42
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愚者517

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
306495799(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-04 08:53:53
1.首先引物必须符合设计原则，引物需与模板特异性结合。
2.你的模板很长，需要调节退火温度。
3.提高琼脂糖凝胶的浓度，由0.8%提高到1%.
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16楼2014-06-12 15:54:59
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-06-12 15:44:42
对上述几对引物进行特异性分析，特异性好些的是502-F/R和754-F/R，其他几对引物的特异性很差。502-F/R的Tm值为60℃，建议采用降落PCR，从65℃降至55℃，每两个循环降低2℃，最后55℃退火25个循环。754-F/R的Tm值为6 ...

我做的降落pcr，从70降到55，0.5一个循环，后来又55退火30循环，延伸都是72度1min，但是最初两次pcr、结果很好，测序是目的条带且单一，但是酶用完，从新拿新的酶又不行了，完全一样的pcr程序啊，后来又55退火同样基因组pcr另一个片段没问题，这个就再也没p出过
复杂模板，pcr，求指导？？？-2
普通pcr，754bp的p不出来，另一个基因位置574没问题.jpg


复杂模板，pcr，求指导？？？-3
重复没p出来.jpg


复杂模板，pcr，求指导？？？-4
最初降落pcr抛出条带，切胶回收，测序正确.jpg
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也许似乎大概是，然而未必不见得
17楼2014-07-03 22:29:12
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-06-11 10:37:49
可以采用好的热启动酶，或采用降落PCR，能很好的减少非特异扩增

我做的降落pcr，从70降到55，0.5一个循环，后来又55退火30循环，延伸都是72度1min，但是最初两次pcr、结果很好，测序是目的条带且单一，但是酶用完，从新拿新的酶又不行了，完全一样的pcr程序啊，后来又55退火同样基因组pcr另一个片段没问题，这个就再也没p出过
复杂模板，pcr，求指导？？？-5
普通pcr，754bp的p不出来，另一个基因位置574没问题.jpg


复杂模板，pcr，求指导？？？-6
重复没p出来.jpg


复杂模板，pcr，求指导？？？-7
最初降落pcr抛出条带，切胶回收，测序正确.jpg
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也许似乎大概是，然而未必不见得
18楼2014-07-03 22:31:52
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
306495799(gyesang代发): 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 10:50:06
你是用的TaKara的酶吗？既然你的另外一个位置的基因片段能扩增出来，说明模板没有问题，换新的酶，同样的程序，可能的原因有以下几个：
1. 引物的质量是否有保证，反复冻融多次引物的效果不会像以前那么好；
2. 不同批次的酶存在一定差异，你的另外一个位置的基因比较容易扩增出来，但是745 bp的基因比较难扩出来，不同批次的酶的效果有少许的差别，也能导致扩增出不来。
建议解决方法：
1. 重新从100 uM的引物稀释至10 uM，用于PCR
2. 再重新拆一支酶试试，配体系时一定要要认真。
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rainwater
19楼2014-07-04 10:58:27
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