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306495799

铁虫 (小有名气)

[求助] 复杂模板,pcr,求指导??? 已有5人参与

复杂模板,染色体脆性位点附近,全基因组PCR换了6对对引物p不出来,主要是杂带太多,主带不明显,切胶回收再进行巢式pcr也试了,同一对引物巢式pcr产物切胶回收测序结果也不对,,换更短片段的引物做巢式pcr主带基本看不见了,杂带还是很多,求指导???我要扩增产物必须包括360~560大小
http://muchong.com/bbs/post.php?action=newthread&fid=366

>gi|568815591|ref|NC_000007.14|:128207397-128208617 Homo sapiens chromosome 7, GRCh38 Primary Assembly
1        GTGGGAACTG GGTGTACTGA CACTGTGGAA CCAAGGAAGC ACCACGGCTG CAGAGAGACC
61       CTGGGCCAGA CCATCCAAAT GAAGCCCAGG CACAGCAGAG GGCTCTGAGG AGGCGCAGGA
121      TGCAGGAGAT GAAAGGGGAA AATGAAGGGG AGCCGCAGGT TCAAACTGCC CCTTCCCAGG
181      AGTGAGCTAC AGCTTGGCCA CTTCTGTCTC ATAAGAAGGA GGTTGTGACT TTGGGAGGTG
241      GAGGGGGATT ACAGCTGGGA TTCCTGTTGC CTGCCTCCTG CCTCTGGGGC TCTCAGCTTT
301      CTCTTCTCCC CAGGACTCTT TTCTTCCTCT CCCCCCACCT CCCCCCCCAC TCCCCTCCTC
361      CCCCTAGGTC CTGGCTCTCC CTCCCCGACC CGGTCTTCTT GGTACCAGCT AAGCCCTGGA
421      GGGGCCACAG CCTCCCCTCC AGCCCCCCTG CCATGGGATG GCTGCTGTCT CCTTTGGATC
481      TTTTTGCGGT CTGGGCTTGC TGTTCCTCTC AACAGTAGTC AGGAAGCCCT TACCCCAAAA
541      AGTATCTGCG GGAGGCCTTG TCCACAGGGG AGGCTGCCCC AAGGGCTCCA GGTGAGTCAC
601      AGCAAACCCA AGAACAGTGA ATGGAACTGG GGTCTCCTGG CTCTCCTTTA GAGTTGCTGA
661      GTGACTTTAA GTCCAGCACT GAGCCTCTCT GGGCCTCACT TATGCCACTC TTTTCATCAT
721      TTACCAGTGG GCAATGTCAA GTGAGAGACT CCACAGATAA GAAAAATAAA GGAGTGGCTC
781      AATTACATGC CAGGGAAAAC CGCTTTGGTG GATGAAGGTC ACACAGCTCT CCCAGCATTC
841      TGTCCTCTGT ATACAGATGA TCTCCTTCTG AAATCCTTTT GGGGATGACC CCCTTCCACA
901      CCATGGACAC TTCTGGGTGG GTTGTCACTC AAGAGGTCCT GCCCTCTTCT GCCCACTGGG
961      TGGACACAAG AATTGAAATC TGTAAAGGAT ACTGAGATTG GGAACAAAAT AATTGATGCT
1021     GATTGATCCC AGCAGTGTAT GGCGAGAAGA TGACAAGCTT CCACTGCCTG TATCACTGAC
1081     TTGCCTAATG TCTGCCCTGC CCTGGCCTGG ATCTTAACCG CGCCCTTCAT TCTGTGAACT
1141     ACCCCCAAAT CCTTCAAATA AAGTCCTTGA TTGCTTGTTA GAGTCAATAA TATTGCTTGC
1201     TGAGGATCCA GAGACCTCTA G
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也许似乎大概是,然而未必不见得
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306495799

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-06-12 15:44:42
对上述几对引物进行特异性分析,特异性好些的是502-F/R和754-F/R,其他几对引物的特异性很差。502-F/R的Tm值为60℃,建议采用降落PCR,从65℃降至55℃,每两个循环降低2℃,最后55℃退火25个循环。754-F/R的Tm值为6 ...

我做的降落pcr,从70降到55,0.5一个循环,后来又55退火30循环,延伸都是72度1min,但是最初两次pcr、结果很好,测序是目的条带且单一,但是酶用完,从新拿新的酶又不行了,完全一样的pcr程序啊,后来又55退火同样基因组pcr另一个片段没问题,这个就再也没p出过
复杂模板,pcr,求指导???
普通pcr,754bp的p不出来,另一个基因位置574没问题.jpg


复杂模板,pcr,求指导???-1
重复没p出来.jpg


复杂模板,pcr,求指导???-2
最初降落pcr抛出条带,切胶回收,测序正确.jpg

也许似乎大概是,然而未必不见得
17楼2014-07-03 22:29:12
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-06-11 12:25:15
可以采用好的热启动酶,或采用降落PCR,能很好的减少非特异扩增
rainwater
2楼2014-06-11 10:37:49
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306495799

铁虫 (小有名气)

我一直用的takara的rtaq,降落pcr循环数怎么控制呢,我之前都是35循环
也许似乎大概是,然而未必不见得
3楼2014-06-11 10:59:45
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duowan17

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
306495799(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-06-11 12:25:29
全基因组PCR出现大量杂带很正常的,因为你引物的特异性对于整个基因组来说基本不可能太特异。
我的建议是:如果有全基因组的序列,寻找基因组上特有的酶切位点(该酶切位点一定要少,但其中两个位点之间能包括你的基因片段,也可以是多个位点),酶切,回收包含有你目的片段的部分,然后作为模板再进行PCR。
4楼2014-06-11 11:02:17
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