| 查看: 1119 | 回复: 1 | ||
[求助]
RT-PCR 疑难杂症求助！
|
|
最近做了3个月的RT-PCR实验，效果一直不太好： 1. 我的目的基因是斑马鱼胚胎-幼鱼阶段甲状腺发育的7个相关基因，可能在96h阶段这些基因的表达水平比较低，所以cDNA样品中基因的丰度低，从而导致部分目的基因的起始Ct值高（有的达到33左右），这样一来我做5个点的4倍稀释标准曲线的Ct范围就很高，同时低丰度也导致扩增效率的不稳定，有的基因只有80%，有的基因又达到120%-160%，最烦恼的是不稳定。 2. 因为这些基因和引物是实验室以前的师姐做过的，在扩增特异性方面没有问题，我前期的预实验溶解曲线也表明确实没有问题，所以我就沿用了她的引物设计。据师姐说她做的某些基因扩增效率也曾有不稳定的现象（高的Ct范围达到37~38左右时），但幸运的是她的cDNA样品中基因表达的丰度都比我的样品要高，所以Ct起始值比我低，标准曲线基本都能基本达标（90%-110%）。（比如我们用同一个管家基因，她的起始Ct为18，我的起始Ct为24） 3. 现在又出现了一个新的问题，我的管家基因的丰度相对还可以，所以它的扩增效率一直也比较稳定，最近管家基因的扩增效率突然降到70%-80%，我依次排查了SYBR GREEN、无酶水、引物和cDNA，仍没有找到原因。 综上所述，我有以下疑问： 1. 我们用一样的Protocol采集斑马鱼的胚胎，什么原因可能导致Blk样品的同一基因表达丰度差异达到几十倍？ 2. 对于低丰度表达的基因，什么办法是效果最好又比较节省试剂的？合成cDNA时提高总RNA的量？RT-PCR时提高cDNA的用量？增加Primer的用量？使用荧光增强剂？ 3. 管家基因的扩增效率突然降低可能有哪些原因？应该如何排查？ 我属于博三换课题，没有生物学背景，没接触过分子生物学，缺乏经验和指导的焦灼状态，迫切渴望得到各位的经验分享和出谋划策！ |
回复此楼» 猜你喜欢
科研人必读：新一代 KRAS G12C 抑制剂 Olomorasib 的研究进展
已经有0人回复
-
BT-11（Omilancor）研究化合物全解析：从分子结构到实验应用要点
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有202人回复
-
富马酸贝达喹啉：二芳基喹啉类工具化合物的化学特征
已经有0人回复
-
BT投稿with editor状态快两周了，正常吗
已经有25人回复
-
Silevertinib（BDTX-1535）结构拆解：炔基双环片段为何成为合成瓶颈
已经有0人回复
-
RO4929097 解析：双苯并氮杂䓬骨架与 Notch 通路实验设计要点
已经有0人回复
-
分子量 1157 的 PROTAC 怎么配不析出：SGK3-PROTAC1 的溶解、分装与图谱复核
已经有0人回复
-
logP 6.1 的羧酸怎么配母液：GSK 650394 的溶解窗口与稀释顺序
已经有0人回复
-
从"水不溶"到 71 mg/mL：雷特格韦的 pH 依赖溶解与螯合色谱边界
已经有0人回复
-
133 Ų 的极性表面积，如何决定 TNG462 的母液配制与色谱条件
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 细菌的RT-PCR求助
已经有6人回复
- RT-PCR的标准曲线的构建相关
已经有3人回复
- 紧急求助！我的RT-PCR数据怎么做成可以发文章的图？
已经有26人回复
- RT-PCR实验操作过程中遇到的问题
已经有15人回复
- RT—PCR引物、条带问题，新手求助，求意见，求建议！
已经有9人回复
- RT-PCR引物稀释问题，欢迎战友们进来指导！急盼中
已经有16人回复
- 半定量RT-PCR与实时定量PCR的研究对象
已经有5人回复
- RT-PCR结果分析求助
已经有5人回复
- RT-PCR时GAPDH条带不一样，目的条带呈涂抹的模糊带如何改进~~
已经有7人回复
- Q-PCR和RT-PCR结果不一致呢？
已经有3人回复
- 着急！RT-PCR扩增效率低，情况很诡异，求助高手帮忙指点
已经有12人回复
- RT-PCR是指实时定量PCR还是逆转录PCR？
已经有7人回复
- 做rt-pcr花钱多不多
已经有19人回复
- rt-pcr图，请大神们帮助分析一下，急。。。谢谢。。。
已经有20人回复
- 求助！关于RT-PCR的问题！
已经有20人回复
- 向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题
已经有9人回复
- ＲＴ－ＰＣＲ问题求助
已经有18人回复
- 【求助/交流】RT-PCR的数据处理
已经有14人回复
- 【求助/交流】RT-PCR ，内参在哪个步骤添加以及marker何时使用及确定？谢谢
已经有14人回复
- 【求助/交流】rt-PCR作出的扩增曲线刚开始为什么会有一条基线？
已经有5人回复
- 【求助/交流】RTPCR 内参
已经有4人回复
- 【求助/交流】大家来讨论下RT-PCR的试剂盒吧！
已经有12人回复
- RT-PCR后的cDNA呢？
已经有17人回复
2楼2014-06-03 23:21:04
