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[求助]
RT-PCR 疑难杂症求助！
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最近做了3个月的RT-PCR实验，效果一直不太好： 1. 我的目的基因是斑马鱼胚胎-幼鱼阶段甲状腺发育的7个相关基因，可能在96h阶段这些基因的表达水平比较低，所以cDNA样品中基因的丰度低，从而导致部分目的基因的起始Ct值高（有的达到33左右），这样一来我做5个点的4倍稀释标准曲线的Ct范围就很高，同时低丰度也导致扩增效率的不稳定，有的基因只有80%，有的基因又达到120%-160%，最烦恼的是不稳定。 2. 因为这些基因和引物是实验室以前的师姐做过的，在扩增特异性方面没有问题，我前期的预实验溶解曲线也表明确实没有问题，所以我就沿用了她的引物设计。据师姐说她做的某些基因扩增效率也曾有不稳定的现象（高的Ct范围达到37~38左右时），但幸运的是她的cDNA样品中基因表达的丰度都比我的样品要高，所以Ct起始值比我低，标准曲线基本都能基本达标（90%-110%）。（比如我们用同一个管家基因，她的起始Ct为18，我的起始Ct为24） 3. 现在又出现了一个新的问题，我的管家基因的丰度相对还可以，所以它的扩增效率一直也比较稳定，最近管家基因的扩增效率突然降到70%-80%，我依次排查了SYBR GREEN、无酶水、引物和cDNA，仍没有找到原因。 综上所述，我有以下疑问： 1. 我们用一样的Protocol采集斑马鱼的胚胎，什么原因可能导致Blk样品的同一基因表达丰度差异达到几十倍？ 2. 对于低丰度表达的基因，什么办法是效果最好又比较节省试剂的？合成cDNA时提高总RNA的量？RT-PCR时提高cDNA的用量？增加Primer的用量？使用荧光增强剂？ 3. 管家基因的扩增效率突然降低可能有哪些原因？应该如何排查？ 我属于博三换课题，没有生物学背景，没接触过分子生物学，缺乏经验和指导的焦灼状态，迫切渴望得到各位的经验分享和出谋划策！ |
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