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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 做TA克隆的时候，用什么做阴性对照
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lmc2537

铜虫 (小有名气)

[求助] 做TA克隆的时候，用什么做阴性对照

向老外要了个目的DNA的质粒，是用TA克隆做的，连带载体也给我寄过来了（这里要感谢老外，真的很友好，直接寄FEDEX过来），两个质粒我都转化了，且能抽出质粒，后面想想不对劲，TA克隆用的载体不是线性的吗？怎么也能够转化呢？不解？目的DNA的质粒我测过序了，的确是包含TA克隆载体的目的DNA质粒，但是载体没有送去测序。这里希望大家能够解答，谢谢！
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1楼2014-05-26 19:42:19
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励热心回帖交流 2014-05-29 13:23:40
引用回帖:
8楼: Originally posted by lmc2537 at 2014-05-29 08:41:55
谢谢你的回答，我最想知道的是做TA克隆的时候，阴性对照就是从公司买过来的吗（买回来的时候是环状？那不用酶切，怎么把它变成线性呢？为什么公司不把质粒先弄成线性？）...

我们作为客户买到的TA克隆载体，肯定都是线性化的。
阴性对照指的是线性化的TA载体片段在加入连接酶以后进行连接转化涂板，理论上应该没有菌落，如果有菌落就说明存在环状质粒。这个质粒的来源可能是原线性化片段中存在环状质粒，或者是载体制作没加好T，发生了自连。一般长上4~5个菌斑属于正常吧，多了就不行，具体可以问公司的质检标准。
对于公司如何制作线性化的TA载体片段，就我有限的知识，一方面是通过平末端连接然后加T，或者是在载体上设计内切酶位点，用酶酶切。
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9楼2014-05-29 10:46:58
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antibodyknow

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 14:18:54
购买的TA克隆载体的确是线性化，但当把目的基因克隆至载体后，将成为环状质粒了。老外送给你的质粒应该是鉴定正确的单克隆质粒，制备的质粒DNA当然是超螺旋环状DNA,自然能够转化进感受态细胞
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2楼2014-05-26 22:13:49
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lmc2537

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by antibodyknow at 2014-05-26 22:13:49
购买的TA克隆载体的确是线性化，但当把目的基因克隆至载体后，将成为环状质粒了。老外送给你的质粒应该是鉴定正确的单克隆质粒，制备的质粒DNA当然是超螺旋环状DNA,自然能够转化进感受态细胞

我的意思是没有连目的基因的质粒怎么也能转化？（老外在一张滤纸上画了两个圈一个是连有目的基因的，一个是没有连的）
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3楼2014-05-27 09:39:14
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 14:19:01
lmc2537: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-05-29 08:42:17
你再仔细看看目的片段的插入位点在哪里，仔细观察插入位点附近的碱基，看看是否是TA克隆。我们一般购买的克隆载体也是从环状的质粒经过处理后得到的线性片段。
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4楼2014-05-27 13:14:16
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lmc2537

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 白菜吃虫 at 2014-05-27 13:14:16
你再仔细看看目的片段的插入位点在哪里，仔细观察插入位点附近的碱基，看看是否是TA克隆。我们一般购买的克隆载体也是从环状的质粒经过处理后得到的线性片段。

确实是TA克隆，对比过了
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5楼2014-05-28 12:55:15
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
lmc2537(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-29 13:23:07
lmc2537: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-05-30 09:28:51
lmc2537: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-05-30 09:32:43
lmc2537: 金币+1 2014-09-01 13:10:04
你的载体的转化率高么？
在载体片段化过程中，可能会混有非常非常非常少量的未能线性化的质粒。
阴性对照一般有两个：1. 只有感受态细菌；2. 不加入载体片段，加入连接酶，然后转化。
都要走完整个转化过程。
如果你实在感兴趣时怎么连的，那就测一个反应吧。
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6楼2014-05-28 13:05:02
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
“的确是包含TA克隆载体的目的DNA质粒”
那还构建啥呢？
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7楼2014-05-28 15:31:58
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lmc2537

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 白菜吃虫 at 2014-05-28 13:05:02
你的载体的转化率高么？
在载体片段化过程中，可能会混有非常非常非常少量的未能线性化的质粒。
阴性对照一般有两个：1. 只有感受态细菌；2. 不加入载体片段，加入连接酶，然后转化。
都要走完整个转化过程。
如 ...

谢谢你的回答，我最想知道的是做TA克隆的时候，阴性对照就是从公司买过来的吗（买回来的时候是环状？那不用酶切，怎么把它变成线性呢？为什么公司不把质粒先弄成线性？）
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8楼2014-05-29 08:41:55
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-30 20:24:40
对于公司如何制作线性化的TA载体片段，就我有限的知识，一方面是在线性化的片段平末端加T，或者是在载体上设计内切酶位点，用酶酶切。
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10楼2014-05-29 10:50:24
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