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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR结果不理想，请教高手。
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andywang6137

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】PCR结果不理想，请教高手。已有15人参与

这是第一次PCR结果，感觉条带不，体系都是按照TaKara 的50ul体系来的。模板，推荐的2.5ng，一般我都用2.5 ul.(反转录前，总RNA稀释了10倍)


就以PCR产物为模板，进行二次PCR。模板量有2.5变为4ul，引物混合物也加倍了，结果还是不好。（第二张图）



后来查看网上需把PCR产物稀释后做模板，，也咨询了师兄，兼并引物条带弱，加大模板或增加循环。综合起来，我就做了如下处理：

（TaKara 50ul推荐体系，buffer 5；Mg2+，3； dNTP 4，模板 2.5ng；引物混合物（20um）2；taq，0.25，剩下的就是加H2O。）

                             原    液      稀释50倍  稀释100倍        原  液

模板量                     2.5  1       2.5     4     4      4          1    1

引物量 （10um）      4     4        8       8     8       8         8    8



以前最多跑35循环，这次加大到45。退火温度50。



结果见第3张图，效果还不如第2张好。



请教高手，这种问题怎么解决。这样的条带能不能做胶回收，T/A克隆。看网上有人说，条带弱，多跑几块胶，一起胶回收，加大量，做T/A克隆，我这个能不能这样做。谢谢！

[ Last edited by andywang6137 on 2010-9-7 at 21:57 ]
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1楼2010-09-07 21:55:29
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周_yan

木虫 (小有名气)
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andywang6137(金币+2):谢谢指点 2010-09-09 16:58:52
跑的不怎么好，都拖尾了，并且目的条带也不是很亮，建议不要回收。
跑的不好，可能是电泳液和上样的问题，建议换一新电泳液再跑一次。
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2楼2010-09-08 09:21:42
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stliimoon

金虫 (小有名气)
andywang6137(金币+4):谢谢指点 2010-09-09 16:59:34
你的这个引物量加的太多了吧！照你这个引物浓度，50ul的体系加入0.5μL就算是最多了吧。taq的量可能也不太好吧，我觉得要是一般的taq，50ul体系加taq0.5ul，要不你这样试试，10*taq buffer,5ul;10um的dNTP 4ul;10um引物,1ul，模板就按你自己的量，taq，0.5ul.其他是水。
同时做一下温度梯度看看。
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3楼2010-09-08 15:21:42
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mgangle

铁杆木虫 (著名写手)

乐乐家族-----乐颠颠
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andywang6137(金币+3):谢谢指点 2010-09-09 16:59:52
我觉得你第二次PCR的时候PCR产物加太多了！因为第一次PCR时就有很多杂带，第二次PCR的模板多，也会相应增加杂带扩增的可能性，所以，你把第一次PCR产物稀释一下再做试试！
要不就是你的引物设计的不太好！个人意见！仅供参考！呵呵！
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麦兜麦兜~~~我要一碗鱼丸粗面。。对不起，么有鱼丸粗面。。那，我要鱼丸么有鱼丸那，我要粗面…………么有粗面那，我要鱼丸粗面……………………
4楼2010-09-08 15:30:44
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陈思容

铜虫 (正式写手)
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andywang6137(金币+2): 2010-09-09 17:00:00
首先考虑是模板的问题，其次提高退火温度
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5楼2010-09-08 15:52:26
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
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andywang6137(金币+2): 2010-09-09 17:00:15
做个温度梯度。 再做个dntp 梯度
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6楼2010-09-08 16:05:56
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乔牛

铁虫 (小有名气)
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andywang6137(金币+1):老板不懂分子，呵呵 2010-09-09 17:00:37
问导师啊，导师总要提点意见吧
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7楼2010-09-08 16:15:30
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bigboy123

铜虫 (小有名气)
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silicare(金币+2):有理 2010-09-09 16:45:54
andywang6137(金币+4):谢谢指点 2010-09-09 17:00:59
在这里见到你的图片了，呵呵！
第一次P不好不建议进行二次P，我以前试过，没有太大意义。
常见原因1. 模板质量不好，样本量少且有降解，或者非新鲜样本，反复冻融次数太多，有其他样本核酸太多。
2. 引物设计不合理，兼并引物对于低拷贝的样本扩增时可能会有扩增效率不高，且结果不稳定现象。
3. 可以送你点PCR增强剂试试，条带肯定会变亮，但不知道对你的系统效果有多大。
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供应PCR增量剂
8楼2010-09-09 11:24:14
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375050424

银虫 (小有名气)
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建议把退火温度设为56或58试试
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9楼2010-09-09 11:36:29
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
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silicare(金币+1):有道理 2010-09-09 16:46:49
andywang6137(金币+4):谢谢指点 2010-09-09 17:01:52
我感觉你以上所有的图片，最漂亮的要算第一张的前四个，所以呢，我建议你将你的模板量加大点，循环数加大点，退火温度降一度，肯定效果会比现在亮，全部点上，基本上全部胶回收就可以做TA克隆了。

如果按照我上面说的，还是没有达到亮度增强的效果，建议你将第一次P出来的产物切胶后浸泡于少量TE中作为模板进行第二次PCR，这样就会去除非特异性扩增，比PCR产物二次P，效果会好很多

另外楼主的体系，引物是加的有些多，50ul体系，10um引物，也就加1-2足以
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10楼2010-09-09 12:39:26
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