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andywang6137木虫 (著名写手)
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[交流]
【求助/交流】PCR结果不理想，请教高手。 已有15人参与
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这是第一次PCR结果，感觉条带不，体系都是按照TaKara 的50ul体系来的。模板，推荐的2.5ng，一般我都用2.5 ul.(反转录前，总RNA稀释了10倍) 就以PCR产物为模板，进行二次PCR。模板量有2.5变为4ul，引物混合物也加倍了，结果还是不好。（第二张图）  后来查看网上需把PCR产物稀释后做模板，，也咨询了师兄，兼并引物条带弱，加大模板或增加循环。综合起来，我就做了如下处理： （TaKara 50ul推荐体系，buffer 5；Mg2+，3； dNTP 4，模板 2.5ng；引物混合物（20um）2；taq，0.25，剩下的就是加H2O。） 原 液 稀释50倍 稀释100倍 原 液 模板量 2.5 1 2.5 4 4 4 1 1 引物量 （10um） 4 4 8 8 8 8 8 8 以前最多跑35循环，这次加大到45。退火温度50。 结果见第3张图，效果还不如第2张好。  请教高手，这种问题怎么解决。这样的条带能不能做胶回收，T/A克隆。看网上有人说，条带弱，多跑几块胶，一起胶回收，加大量，做T/A克隆，我这个能不能这样做。谢谢！ [ Last edited by andywang6137 on 2010-9-7 at 21:57 ] |
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2楼2010-09-08 09:21:42
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mgangle
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silicare(金币+2):有理 2010-09-09 16:45:54
andywang6137(金币+4):谢谢指点 2010-09-09 17:00:59
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andywang6137(金币+4):谢谢指点 2010-09-09 17:00:59
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在这里见到你的图片了，呵呵！ 第一次P不好不建议进行二次P，我以前试过，没有太大意义。 常见原因1. 模板质量不好，样本量少且有降解，或者非新鲜样本，反复冻融次数太多，有其他样本核酸太多。 2. 引物设计不合理，兼并引物对于低拷贝的样本扩增时可能会有扩增效率不高，且结果不稳定现象。 3. 可以送你点PCR增强剂试试，条带肯定会变亮，但不知道对你的系统效果有多大。 |
8楼2010-09-09 11:24:14
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yujiaping1
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silicare(金币+1):有道理 2010-09-09 16:46:49
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我感觉你以上所有的图片，最漂亮的要算第一张的前四个，所以呢，我建议你将你的模板量加大点，循环数加大点，退火温度降一度，肯定效果会比现在亮，全部点上，基本上全部胶回收就可以做TA克隆了。 如果按照我上面说的，还是没有达到亮度增强的效果，建议你将第一次P出来的产物切胶后浸泡于少量TE中作为模板进行第二次PCR，这样就会去除非特异性扩增，比PCR产物二次P，效果会好很多 另外楼主的体系，引物是加的有些多，50ul体系，10um引物，也就加1-2足以 |
10楼2010-09-09 12:39:26
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