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andywang6137木虫 (著名写手)
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[交流]
【求助/交流】PCR结果不理想，请教高手。已有15人参与
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这是第一次PCR结果，感觉条带不，体系都是按照TaKara 的50ul体系来的。模板，推荐的2.5ng，一般我都用2.5 ul.(反转录前，总RNA稀释了10倍) 就以PCR产物为模板，进行二次PCR。模板量有2.5变为4ul，引物混合物也加倍了，结果还是不好。（第二张图）  后来查看网上需把PCR产物稀释后做模板，，也咨询了师兄，兼并引物条带弱，加大模板或增加循环。综合起来，我就做了如下处理： （TaKara 50ul推荐体系，buffer 5；Mg2+，3； dNTP 4，模板 2.5ng；引物混合物（20um）2；taq，0.25，剩下的就是加H2O。） 原 液 稀释50倍 稀释100倍 原 液 模板量 2.5 1 2.5 4 4 4 1 1 引物量 （10um） 4 4 8 8 8 8 8 8 以前最多跑35循环，这次加大到45。退火温度50。 结果见第3张图，效果还不如第2张好。  请教高手，这种问题怎么解决。这样的条带能不能做胶回收，T/A克隆。看网上有人说，条带弱，多跑几块胶，一起胶回收，加大量，做T/A克隆，我这个能不能这样做。谢谢！ [ Last edited by andywang6137 on 2010-9-7 at 21:57 ] |
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