| 查看: 3175 | 回复: 17 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
andywang6137木虫 (著名写手)
|
[交流]
【求助/交流】PCR结果不理想，请教高手。 已有15人参与
|
||
这是第一次PCR结果，感觉条带不，体系都是按照TaKara 的50ul体系来的。模板，推荐的2.5ng，一般我都用2.5 ul.(反转录前，总RNA稀释了10倍) 就以PCR产物为模板，进行二次PCR。模板量有2.5变为4ul，引物混合物也加倍了，结果还是不好。（第二张图）  后来查看网上需把PCR产物稀释后做模板，，也咨询了师兄，兼并引物条带弱，加大模板或增加循环。综合起来，我就做了如下处理： （TaKara 50ul推荐体系，buffer 5；Mg2+，3； dNTP 4，模板 2.5ng；引物混合物（20um）2；taq，0.25，剩下的就是加H2O。） 原 液 稀释50倍 稀释100倍 原 液 模板量 2.5 1 2.5 4 4 4 1 1 引物量 （10um） 4 4 8 8 8 8 8 8 以前最多跑35循环，这次加大到45。退火温度50。 结果见第3张图，效果还不如第2张好。  请教高手，这种问题怎么解决。这样的条带能不能做胶回收，T/A克隆。看网上有人说，条带弱，多跑几块胶，一起胶回收，加大量，做T/A克隆，我这个能不能这样做。谢谢！ [ Last edited by andywang6137 on 2010-9-7 at 21:57 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有169人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 请教RNA提取高手：反转录PCR（RT-PCR)中DNA的去除
已经有18人回复
- 请教如何找内含子，求教高手，急！！
已经有4人回复
- 两个基因序列能不能做荧光定量PCR？请教大家一下！！！
已经有4人回复
- 请教real time pcr问题，谢谢！
已经有10人回复
- 向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题
已经有9人回复
- PCR 扩全长
已经有20人回复
- 【求助/交流】关于荧光定量PCR的小问题,请高手指点 【问题已解决】
已经有7人回复
- 【求助/交流】怎么就是p不出目的片段啊
已经有16人回复
- 【求助/交流】（5.20更新）PCR产物电泳没有条带，why?
已经有20人回复
- 【求助/交流】Real time RT-PCR 引物设计问题（高悬赏请高手帮忙）
已经有28人回复
bigboy123
铜虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 149.8
- 散金: 7
- 帖子: 84
- 在线: 13.3小时
- 虫号: 381419
- 注册: 2007-05-24
- 专业: 生物大分子结构与功能
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+2):有理 2010-09-09 16:45:54
andywang6137(金币+4):谢谢指点 2010-09-09 17:00:59
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+2):有理 2010-09-09 16:45:54
andywang6137(金币+4):谢谢指点 2010-09-09 17:00:59
|
在这里见到你的图片了，呵呵！ 第一次P不好不建议进行二次P，我以前试过，没有太大意义。 常见原因1. 模板质量不好，样本量少且有降解，或者非新鲜样本，反复冻融次数太多，有其他样本核酸太多。 2. 引物设计不合理，兼并引物对于低拷贝的样本扩增时可能会有扩增效率不高，且结果不稳定现象。 3. 可以送你点PCR增强剂试试，条带肯定会变亮，但不知道对你的系统效果有多大。 |
8楼2010-09-09 11:24:14
2楼2010-09-08 09:21:42
3楼2010-09-08 15:21:42
mgangle
铁杆木虫 (著名写手)
乐乐家族-----乐颠颠
- 应助: 16 (小学生)
- 金币: 9313.9
- 散金: 200
- 沙发: 1
- 帖子: 2567
- 在线: 475.8小时
- 虫号: 512931
- 注册: 2008-02-27
- 专业: 植物病理学
4楼2010-09-08 15:30:44
投票:
10