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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » His标签蛋白纯化后，有杂带
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lvsunjian

新虫 (小有名气)

[交流] His标签蛋白纯化后，有杂带 已有6人参与

菌液诱导表达过夜后，用PBS悬浮细胞，超声破碎。
离心后取上清液上柱（生工的柱子）。
用10ml, Ni-Native-0平衡；
上样；
再用5ml, Ni-Native-20洗脱，得到3管样品；
接下来用5ml, Ni-Native-250洗脱，得到4管样品；
结果如下：
Marker，阴性对照，阳性对照，N20-1，N20-2，N20-3，N250-1，N250-2，N250-3，N250-4，没管收集1ml。
我想知道，杂蛋白是如何去除的？是通过低浓度的Ni-Native逐步洗脱的还是？
用Ni-Native-0，20，50，100，250，我怕把样品都洗脱没了~

His标签蛋白纯化后，有杂带
1.jpg
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1楼 2014-05-23 11:16:45
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lvsunjian

新虫 (小有名气)
忘大家帮忙看下，楼主小虫一只，金币不多~
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2楼2014-05-23 11:17:46
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yuanbo934

至尊木虫 (职业作家)
★
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考虑再过个阴离子或阳离子柱，或硫酸铵分级沉淀等方法。
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3楼2014-05-23 14:53:40
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)
★
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洗脱从20直接跳到250，这样的确很容易有杂蛋白的，可以在中间多加一些梯度，如50、100等等。还有你只用20洗了3次吗？为什么不多洗几次把多一点杂蛋白洗下来啊？
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4楼2014-05-23 17:53:58
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lvsunjian

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuderong at 2014-05-23 17:53:58
洗脱从20直接跳到250，这样的确很容易有杂蛋白的，可以在中间多加一些梯度，如50、100等等。还有你只用20洗了3次吗？为什么不多洗几次把多一点杂蛋白洗下来啊？

我用20洗的时候，用了5毫升，接了三管。第一次就想看看融合蛋白的表达情况。

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2014-05-23 18:53:10
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
5楼: Originally posted by lvsunjian at 2014-05-23 18:53:10
我用20洗的时候，用了5毫升，接了三管。第一次就想看看融合蛋白的表达情况。
...

看你的电泳图，20洗三次之后还有很多杂蛋白，可以多洗几次，这个浓度目的蛋白又洗不下来。我做的话每一个梯度都会洗到没有蛋白洗脱下来。
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6楼2014-05-23 23:57:37
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PI4K

新虫 (初入文坛)
★
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1. What's your buffer and pH?
2. purification condition? NaCl, temperature?
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7楼2014-05-25 07:02:27
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treetreew

木虫 (小有名气)
★
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找个akta泡个梯度
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8楼2014-05-25 12:14:51
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cascade900

新虫 (初入文坛)
★
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换个PH试试，wash体积大一些
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9楼2014-05-28 15:32:58
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我叫王木木

新虫 (小有名气)
★
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Ni-Native-0，20，50，100，250，怎么配的，求问
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有不为
10楼2018-04-07 18:13:38
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