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lvsunjian

新虫 (小有名气)

[交流] His标签蛋白纯化后,有杂带已有6人参与

菌液诱导表达过夜后,用PBS悬浮细胞,超声破碎。
离心后取上清液上柱(生工的柱子)。
用10ml, Ni-Native-0平衡;
上样;
再用5ml, Ni-Native-20洗脱,得到3管样品;
接下来用5ml, Ni-Native-250洗脱,得到4管样品;
结果如下:
Marker,阴性对照,阳性对照,N20-1,N20-2,N20-3,N250-1,N250-2,N250-3,N250-4,没管收集1ml。
我想知道,杂蛋白是如何去除的?是通过低浓度的Ni-Native逐步洗脱的还是?
用Ni-Native-0,20,50,100,250,我怕把样品都洗脱没了~

His标签蛋白纯化后,有杂带
1.jpg
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lvsunjian

新虫 (小有名气)

忘大家帮忙看下,楼主小虫一只,金币不多~
2楼2014-05-23 11:17:46
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
考虑再过个阴离子或阳离子柱,或硫酸铵分级沉淀等方法。
3楼2014-05-23 14:53:40
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
洗脱从20直接跳到250,这样的确很容易有杂蛋白的,可以在中间多加一些梯度,如50、100等等。还有你只用20洗了3次吗?为什么不多洗几次把多一点杂蛋白洗下来啊?
4楼2014-05-23 17:53:58
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lvsunjian

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by liuderong at 2014-05-23 17:53:58
洗脱从20直接跳到250,这样的确很容易有杂蛋白的,可以在中间多加一些梯度,如50、100等等。还有你只用20洗了3次吗?为什么不多洗几次把多一点杂蛋白洗下来啊?

我用20洗的时候,用了5毫升,接了三管。第一次就想看看融合蛋白的表达情况。

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2014-05-23 18:53:10
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by lvsunjian at 2014-05-23 18:53:10
我用20洗的时候,用了5毫升,接了三管。第一次就想看看融合蛋白的表达情况。
...

看你的电泳图,20洗三次之后还有很多杂蛋白,可以多洗几次,这个浓度目的蛋白又洗不下来。我做的话每一个梯度都会洗到没有蛋白洗脱下来。
6楼2014-05-23 23:57:37
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PI4K

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
1. What's your buffer and pH?
2. purification condition? NaCl, temperature?
7楼2014-05-25 07:02:27
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treetreew

木虫 (小有名气)


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找个akta泡个梯度
8楼2014-05-25 12:14:51
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cascade900

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
换个PH试试,wash体积大一些
9楼2014-05-28 15:32:58
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我叫王木木

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
Ni-Native-0,20,50,100,250,怎么配的,求问
有不为
10楼2018-04-07 18:13:38
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