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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 新手做荧光定量PCR几个疑问求解答！！
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梦梦神

新虫 (初入文坛)

[求助] 新手做荧光定量PCR几个疑问求解答！！ 已有4人参与

1.绝对定量标曲一般是做克隆通过重组质粒构建起来，但有的文献标准品直接用普通PCR产物纯化后来做成标曲，后者方法简单但是不是有什么缺陷啊？？没做过克隆的想偷懒用后面的方法做标曲啊！！求指点。
2.标准品拷贝数是根据浓度计算出来的对吧？这个浓度要用什么仪器测呢？
3.如果做相对定量，细菌的内参基因（管家基因？持家基因？）一般用什么啊，跟绝对定量相比两者哪个更方便或更可信？
PS：本人实验目的是看不同时期基因表达量，我觉得两种方法都能满足需求，求指点！
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1楼 2014-05-17 11:36:05
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

爱睡猪

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
梦梦神(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-05-19 20:22:27
引用回帖:
3楼: Originally posted by 梦梦神 at 2014-05-18 22:53:22
相对定量不知道该用哪个内参，很多文献都做的绝对定量，然后相对定量的也没提内参，求指点！...

绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为 100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。
PS：你是要做细菌的某种基因的表达量，那就选择细菌的基因做内参，比如16S,要是做细菌处理后宿主的话，那就看宿主的内参，文献都有的，自己看
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ControlMyself
7楼2014-05-19 15:33:29
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-19 00:05:07
梦梦神: 金币+5 2014-05-22 13:21:05
ΔΔct法 相对定量就行了啦，前提是保证引物的扩增效率，一般直接从文献里面拿，验证好了就可以用了
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ControlMyself
2楼2014-05-18 11:37:32
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梦梦神

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 爱睡猪 at 2014-05-18 11:37:32
ΔΔct法 相对定量就行了啦，前提是保证引物的扩增效率，一般直接从文献里面拿，验证好了就可以用了

相对定量不知道该用哪个内参，很多文献都做的绝对定量，然后相对定量的也没提内参，求指点！
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3楼2014-05-18 22:53:22
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
通过OD280测DNA浓度，单位μg或ng
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4楼2014-05-19 09:25:05
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爱上鱼……

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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梦梦神(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-19 20:21:51
觉得pcr纯化产物跟质粒差不多，只是质粒更稳定点，
测浓度，用紫外可见分光光度计，根据OD260来估算……
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懒病又犯了……
5楼2014-05-19 09:28:39
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江心汀

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
梦梦神(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-19 20:22:01
为正确性，现在都流行将多设几个内参做个实验，比如actin,tublin,GAPDH，都是传统的持家基因，你可以看看相关文献
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6楼2014-05-19 09:53:17
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梦梦神

新虫 (初入文坛)
内容已删除
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8楼2014-05-22 13:11:43
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梦梦神

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 爱睡猪 at 2014-05-19 15:33:29
绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。举例来说，如果研究项目中包括 ...

谢谢谢谢！
还有相对定量的话也是一样要做标曲对吗？不需要知道准确拷贝数。
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9楼2014-05-22 13:14:27
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mehongyu

新虫 (初入文坛)
那得看你要定量的样本是什么了，如果你要定量的东西量多的话，用普通PCR纯化的产物是起不到校正作用的
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10楼2014-05-22 15:01:57
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