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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 新手做荧光定量PCR几个疑问求解答！！
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梦梦神

新虫 (初入文坛)

[求助] 新手做荧光定量PCR几个疑问求解答！！ 已有4人参与

1.绝对定量标曲一般是做克隆通过重组质粒构建起来，但有的文献标准品直接用普通PCR产物纯化后来做成标曲，后者方法简单但是不是有什么缺陷啊？？没做过克隆的想偷懒用后面的方法做标曲啊！！求指点。
2.标准品拷贝数是根据浓度计算出来的对吧？这个浓度要用什么仪器测呢？
3.如果做相对定量，细菌的内参基因（管家基因？持家基因？）一般用什么啊，跟绝对定量相比两者哪个更方便或更可信？
PS：本人实验目的是看不同时期基因表达量，我觉得两种方法都能满足需求，求指点！
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1楼 2014-05-17 11:36:05
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爱上鱼……

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
梦梦神(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-19 20:21:51
觉得pcr纯化产物跟质粒差不多，只是质粒更稳定点，
测浓度，用紫外可见分光光度计，根据OD260来估算……
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懒病又犯了……
5楼2014-05-19 09:28:39
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-19 00:05:07
梦梦神: 金币+5 2014-05-22 13:21:05
ΔΔct法 相对定量就行了啦，前提是保证引物的扩增效率，一般直接从文献里面拿，验证好了就可以用了
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ControlMyself
2楼2014-05-18 11:37:32
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梦梦神

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 爱睡猪 at 2014-05-18 11:37:32
ΔΔct法 相对定量就行了啦，前提是保证引物的扩增效率，一般直接从文献里面拿，验证好了就可以用了

相对定量不知道该用哪个内参，很多文献都做的绝对定量，然后相对定量的也没提内参，求指点！
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3楼2014-05-18 22:53:22
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
通过OD280测DNA浓度，单位μg或ng
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4楼2014-05-19 09:25:05
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