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louisjackson

金虫 (小有名气)

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专业: 胎儿发育与产前诊断

[求助] 全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！已有5人参与

我的模板是逆转录的cDNA，然后P出全长序列后准备连接载体，但是跑出来的条带不是目的条带，不知是不是我的引物设计有问题。
基因信息：Homo sapiens msh homeobox 2 (MSX2), mRNA
NCBI Reference Sequence: NM_002449.4
CDS          89..892
Sample Text
Primer pair 1
Sequence (5'->3')                               Length    Tm          GC% Self complementarity    Self 3' complementarity
Forward primer ATGGCTTCTCCGTCCAAAGG 20 60.04 55.00       3.00                                        1.00
Reverse primer TTAGGACAGGTGGTACATGCC 21 59.44 52.38       4.00                                        3.00
Products on target templates
Sample Text
>NM_002449.4 Homo sapiens msh homeobox 2 (MSX2), mRNA
product length = 804
Forward primer  1 ATGGCTTCTCCGTCCAAAGG  20
Template       89  ....................  108
Reverse primer  1 TTAGGACAGGTGGTACATGCC  21
Template       892  .....................  872
这是我跑出来的条带的位置，完全不是我想要的目的条带的位置。请各位大神帮我分析一下原因，谢谢啦！

JAR GAPDH AND MSX2 FULL-LENGH 2014-05-08 15hr 24min_副本.jpg

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It'snotaboutskill,butaboutwill.

1楼 2014-05-12 14:30:47

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luwei13566

木虫 (正式写手)

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★ ★ ★
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-14 09:11:44

引用回帖:

7楼: Originally posted by louisjackson at 2014-05-12 18:58:23
我想请教一下，您的全长引物是如何设计的？我是用的在线设计软件，用前面一段序列设计一对引物，采用其上游引物；用后面一段序列设计一对引物，采用其下游引物。最后再将这上下游引物作为一对引物送去合成，然后我 ...

引物包含起始子和终止子没什么问题，关键看你设计出来的引物大小和退火温度，设计出来的引物自身互补是否严重，和两条引物之间的互补程度，退火温度就不说了，引物的自身互补主要需要软件来预测，如果完全不互补当然最好，如果有互补最好不要出现在引物的开头和结尾，互补最好不要超过3个，也不要出现你的下游引物那样的分段互补，而且自身互补一般带有一个结构最小自由能，是0或者一个负数，不看负号，这个值越大说明这种颈环结构越容易形成，一般不超过-1的都没太大影响。如果真是出现了不能忽视的颈环可以适当添加或去除碱基，一个一个试，并注意退火温度的变化，一般两条引物退火温度差+ —5度问题不大。最后设计好后两条引物测试下两引物之间互补性，只要不出现太离谱的大规模互补都没啥问题。