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louisjackson金虫 (小有名气)
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[求助]
全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！ 已有5人参与
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我的模板是逆转录的cDNA，然后P出全长序列后准备连接载体，但是跑出来的条带不是目的条带，不知是不是我的引物设计有问题。 基因信息：Homo sapiens msh homeobox 2 (MSX2), mRNA NCBI Reference Sequence: NM_002449.4 CDS 89..892 Sample Text Primer pair 1 Sequence (5'->3') Length Tm GC% Self complementarity Self 3' complementarity Forward primer ATGGCTTCTCCGTCCAAAGG 20 60.04 55.00 3.00 1.00 Reverse primer TTAGGACAGGTGGTACATGCC 21 59.44 52.38 4.00 3.00 Products on target templates Sample Text >NM_002449.4 Homo sapiens msh homeobox 2 (MSX2), mRNA product length = 804 Forward primer 1 ATGGCTTCTCCGTCCAAAGG 20 Template 89 .................... 108 Reverse primer 1 TTAGGACAGGTGGTACATGCC 21 Template 892 ..................... 872 这是我跑出来的条带的位置，完全不是我想要的目的条带的位置。请各位大神帮我分析一下原因，谢谢啦！  JAR GAPDH AND MSX2 FULL-LENGH 2014-05-08 15hr 24min_副本.jpg |
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 沙漏 |
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louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-14 09:11:44
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-14 09:11:44
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引物包含起始子和终止子没什么问题，关键看你设计出来的引物大小和退火温度，设计出来的引物自身互补是否严重，和两条引物之间的互补程度，退火温度就不说了，引物的自身互补主要需要软件来预测，如果完全不互补当然最好，如果有互补最好不要出现在引物的开头和结尾，互补最好不要超过3个，也不要出现你的下游引物那样的分段互补，而且自身互补一般带有一个结构最小自由能，是0或者一个负数，不看负号，这个值越大说明这种颈环结构越容易形成，一般不超过-1的都没太大影响。如果真是出现了不能忽视的颈环可以适当添加或去除碱基，一个一个试，并注意退火温度的变化，一般两条引物退火温度差+ —5度问题不大。最后设计好后两条引物测试下两引物之间互补性，只要不出现太离谱的大规模互补都没啥问题。 |
9楼2014-05-12 20:08:13
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