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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！
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louisjackson

金虫 (小有名气)

[求助] 全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！ 已有5人参与

我的模板是逆转录的cDNA，然后P出全长序列后准备连接载体，但是跑出来的条带不是目的条带，不知是不是我的引物设计有问题。
基因信息：Homo sapiens msh homeobox 2 (MSX2), mRNA
NCBI Reference Sequence: NM_002449.4
CDS             89..892
Sample Text
Primer pair 1
        Sequence (5'->3')                                    Length          Tm                 GC%    Self complementarity      Self 3' complementarity
Forward primer        ATGGCTTCTCCGTCCAAAGG        20        60.04        55.00             3.00                                             1.00
Reverse primer        TTAGGACAGGTGGTACATGCC        21        59.44        52.38             4.00                                             3.00
Products on target templates
Sample Text
>NM_002449.4 Homo sapiens msh homeobox 2 (MSX2), mRNA
product length = 804
Forward primer  1   ATGGCTTCTCCGTCCAAAGG  20
Template        89  ....................  108
Reverse primer  1    TTAGGACAGGTGGTACATGCC  21
Template        892  .....................  872
这是我跑出来的条带的位置，完全不是我想要的目的条带的位置。请各位大神帮我分析一下原因，谢谢啦！

全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！
JAR GAPDH AND MSX2 FULL-LENGH 2014-05-08 15hr 24min_副本.jpg
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
1楼 2014-05-12 14:30:47
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-12 17:55:38
你PCR出来的条带跟Marker比是小了一点，但我感觉这个条带是特异性的，你可以回收出来连接到载体上测序试试
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-05-12 15:11:01
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-12 17:55:51
稍微偏小了50bp多一些，而且从图上看貌似你的亮带上方有些模糊的条带，建议回收PCR产物直接送公司测序，先看看序列再说。
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大家相互帮助哈
3楼2014-05-12 15:24:35
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louisjackson

金虫 (小有名气)
这是我测序后比对结果的截图，应该是前面与后面都有丢失，但即使匹配的部分突变点也很多！
全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！-1
TM截图未命名.png
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
4楼2014-05-12 16:27:12
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-12 17:56:27
先不管中间的点突变，LZ你基因测序出来有多大？blast出来467个匹配，你P出的基因前端后端是不是有一部分和已知序列不一样？
这是你引物自身互补的图
上游：
全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！-2
下游：
全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！-3

你的引物可能还得再设计一下，至少不要离开头和结尾很近的地方出现颈环结构
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大家相互帮助哈
5楼2014-05-12 16:55:19
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louisjackson

金虫 (小有名气)
我测序出来只有542个bp，然后匹配的就只有467个。真像你所说的，前面跟后面都有一部分是跟目的序列不一样的。那这是否就跟我引物自身互补有关呢？还有关于引物自身互补，应该控制在一个多大范围才好呢？谢谢啦！
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
6楼2014-05-12 17:06:35
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louisjackson

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-12 16:55:19
先不管中间的点突变，LZ你基因测序出来有多大？blast出来467个匹配，你P出的基因前端后端是不是有一部分和已知序列不一样？
这是你引物自身互补的图
上游：

下游：


你的引物可能还得再设计一下，至少不要 ...

我想请教一下，您的全长引物是如何设计的？我是用的在线设计软件，用前面一段序列设计一对引物，采用其上游引物；用后面一段序列设计一对引物，采用其下游引物。最后再将这上下游引物作为一对引物送去合成，然后我设计出来的引物就刚好踩着起始子和终止子的，请问这种方法有没有问题呢？如果不行，可不可以传授一种设计全长引物的方法呢？谢谢！
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
7楼2014-05-12 18:58:23
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by louisjackson at 2014-05-12 18:58:23
我想请教一下，您的全长引物是如何设计的？我是用的在线设计软件，用前面一段序列设计一对引物，采用其上游引物；用后面一段序列设计一对引物，采用其下游引物。最后再将这上下游引物作为一对引物送去合成，然后我 ...

建议用primer-blast，tm设计为60上下，试试

[ 发自小木虫客户端 ]
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8楼2014-05-12 19:59:59
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-14 09:11:44
引用回帖:
7楼: Originally posted by louisjackson at 2014-05-12 18:58:23
我想请教一下，您的全长引物是如何设计的？我是用的在线设计软件，用前面一段序列设计一对引物，采用其上游引物；用后面一段序列设计一对引物，采用其下游引物。最后再将这上下游引物作为一对引物送去合成，然后我 ...

引物包含起始子和终止子没什么问题，关键看你设计出来的引物大小和退火温度，设计出来的引物自身互补是否严重，和两条引物之间的互补程度，退火温度就不说了，引物的自身互补主要需要软件来预测，如果完全不互补当然最好，如果有互补最好不要出现在引物的开头和结尾，互补最好不要超过3个，也不要出现你的下游引物那样的分段互补，而且自身互补一般带有一个结构最小自由能，是0或者一个负数，不看负号，这个值越大说明这种颈环结构越容易形成，一般不超过-1的都没太大影响。如果真是出现了不能忽视的颈环可以适当添加或去除碱基，一个一个试，并注意退火温度的变化，一般两条引物退火温度差+ —5度问题不大。最后设计好后两条引物测试下两引物之间互补性，只要不出现太离谱的大规模互补都没啥问题。
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9楼2014-05-12 20:08:13
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by louisjackson at 2014-05-12 17:06:35
我测序出来只有542个bp，然后匹配的就只有467个。真像你所说的，前面跟后面都有一部分是跟目的序列不一样的。那这是否就跟我引物自身互补有关呢？还有关于引物自身互补，应该控制在一个多大范围才好呢？谢谢啦！

你测序后的序列前后有没有你的引物序列~，
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10楼2014-05-12 20:12:46
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