应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！
181/2返回列表12下一页
查看: 3597  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

louisjackson

金虫 (小有名气)

[求助] 全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！ 已有5人参与

我的模板是逆转录的cDNA，然后P出全长序列后准备连接载体，但是跑出来的条带不是目的条带，不知是不是我的引物设计有问题。
基因信息：Homo sapiens msh homeobox 2 (MSX2), mRNA
NCBI Reference Sequence: NM_002449.4
CDS             89..892
Sample Text
Primer pair 1
        Sequence (5'->3')                                    Length          Tm                 GC%    Self complementarity      Self 3' complementarity
Forward primer        ATGGCTTCTCCGTCCAAAGG        20        60.04        55.00             3.00                                             1.00
Reverse primer        TTAGGACAGGTGGTACATGCC        21        59.44        52.38             4.00                                             3.00
Products on target templates
Sample Text
>NM_002449.4 Homo sapiens msh homeobox 2 (MSX2), mRNA
product length = 804
Forward primer  1   ATGGCTTCTCCGTCCAAAGG  20
Template        89  ....................  108
Reverse primer  1    TTAGGACAGGTGGTACATGCC  21
Template        892  .....................  872
这是我跑出来的条带的位置，完全不是我想要的目的条带的位置。请各位大神帮我分析一下原因，谢谢啦！

全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！
JAR GAPDH AND MSX2 FULL-LENGH 2014-05-08 15hr 24min_副本.jpg
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

沙漏

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
It'snotaboutskill,butaboutwill.
1楼 2014-05-12 14:30:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-12 17:55:38
你PCR出来的条带跟Marker比是小了一点，但我感觉这个条带是特异性的，你可以回收出来连接到载体上测序试试
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-05-12 15:11:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-12 17:55:51
稍微偏小了50bp多一些，而且从图上看貌似你的亮带上方有些模糊的条带，建议回收PCR产物直接送公司测序，先看看序列再说。
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
3楼2014-05-12 15:24:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

louisjackson

金虫 (小有名气)
这是我测序后比对结果的截图，应该是前面与后面都有丢失，但即使匹配的部分突变点也很多！
全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！-1
TM截图未命名.png
赞一下 回复此楼
It'snotaboutskill,butaboutwill.
4楼2014-05-12 16:27:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-12 17:56:27
先不管中间的点突变，LZ你基因测序出来有多大？blast出来467个匹配，你P出的基因前端后端是不是有一部分和已知序列不一样？
这是你引物自身互补的图
上游：
全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！-2
下游：
全长引物一直P不出目的条带来，请大神看一下我的引物设计有没有问题？谢啦！-3

你的引物可能还得再设计一下，至少不要离开头和结尾很近的地方出现颈环结构
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
5楼2014-05-12 16:55:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

louisjackson

金虫 (小有名气)
我测序出来只有542个bp，然后匹配的就只有467个。真像你所说的，前面跟后面都有一部分是跟目的序列不一样的。那这是否就跟我引物自身互补有关呢？还有关于引物自身互补，应该控制在一个多大范围才好呢？谢谢啦！
赞一下 回复此楼
It'snotaboutskill,butaboutwill.
6楼2014-05-12 17:06:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

louisjackson

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-12 16:55:19
先不管中间的点突变，LZ你基因测序出来有多大？blast出来467个匹配，你P出的基因前端后端是不是有一部分和已知序列不一样？
这是你引物自身互补的图
上游：

下游：


你的引物可能还得再设计一下，至少不要 ...

我想请教一下，您的全长引物是如何设计的？我是用的在线设计软件，用前面一段序列设计一对引物，采用其上游引物；用后面一段序列设计一对引物，采用其下游引物。最后再将这上下游引物作为一对引物送去合成，然后我设计出来的引物就刚好踩着起始子和终止子的，请问这种方法有没有问题呢？如果不行，可不可以传授一种设计全长引物的方法呢？谢谢！
赞一下 回复此楼
It'snotaboutskill,butaboutwill.
7楼2014-05-12 18:58:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by louisjackson at 2014-05-12 18:58:23
我想请教一下，您的全长引物是如何设计的？我是用的在线设计软件，用前面一段序列设计一对引物，采用其上游引物；用后面一段序列设计一对引物，采用其下游引物。最后再将这上下游引物作为一对引物送去合成，然后我 ...

建议用primer-blast，tm设计为60上下，试试

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
8楼2014-05-12 19:59:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-14 09:11:44
引用回帖:
7楼: Originally posted by louisjackson at 2014-05-12 18:58:23
我想请教一下，您的全长引物是如何设计的？我是用的在线设计软件，用前面一段序列设计一对引物，采用其上游引物；用后面一段序列设计一对引物，采用其下游引物。最后再将这上下游引物作为一对引物送去合成，然后我 ...

引物包含起始子和终止子没什么问题，关键看你设计出来的引物大小和退火温度，设计出来的引物自身互补是否严重，和两条引物之间的互补程度，退火温度就不说了，引物的自身互补主要需要软件来预测，如果完全不互补当然最好，如果有互补最好不要出现在引物的开头和结尾，互补最好不要超过3个，也不要出现你的下游引物那样的分段互补，而且自身互补一般带有一个结构最小自由能，是0或者一个负数，不看负号，这个值越大说明这种颈环结构越容易形成，一般不超过-1的都没太大影响。如果真是出现了不能忽视的颈环可以适当添加或去除碱基，一个一个试，并注意退火温度的变化，一般两条引物退火温度差+ —5度问题不大。最后设计好后两条引物测试下两引物之间互补性，只要不出现太离谱的大规模互补都没啥问题。
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
9楼2014-05-12 20:08:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by louisjackson at 2014-05-12 17:06:35
我测序出来只有542个bp，然后匹配的就只有467个。真像你所说的，前面跟后面都有一部分是跟目的序列不一样的。那这是否就跟我引物自身互补有关呢？还有关于引物自身互补，应该控制在一个多大范围才好呢？谢谢啦！

你测序后的序列前后有没有你的引物序列~，
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
10楼2014-05-12 20:12:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 louisjackson 的主题更新
181/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-29 09:17 by G6APbkg8SA6w
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 07:46 by gy1nBQXYQJqL
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-29 07:32 by winsaint
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 05:45 by gy1nBQXYQJqL
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +13 晴天加油 2026-08-26 14/700 2026-08-28 18:36 by huagongfeihu
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +8 苏东坡二世 2026-08-23 8/400 2026-08-28 14:41 by lkforward
[基金申请] 基金不中，共勉 +11 eulota 2026-08-26 11/550 2026-08-28 14:22 by 火星超人xi
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[职场人生] 学生撞见辅导员送外卖，第二天全班都沉默了 +3 鲸鱼融金_浙江_� 2026-08-22 3/150 2026-08-26 09:01 by zzuzxg
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭