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zhangjie_924

新虫 (小有名气)

[求助] 如何处理后盐酸胍变性的蛋白液,跑SDS-PAGE电泳。 已有1人参与

最近在做蛋白的纯化,蛋白分离后,用盐酸胍变性,通过AKTA纯化蛋白,但没有收集到蛋白。想知道蛋白液是否在挂柱子时流失,想对挂柱子的流出液跑SDS-PAGE胶检测,但是流出液中有盐酸胍,遇到loadingbuffere 析出白色物质,无法跑电泳,这里求助高手,怎样处理含有盐酸胍的样本来跑SDS-PAGE电泳。先谢谢谢谢啦,请各位高手多多帮助
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anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhangjie_924: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 非常感谢 2014-05-12 09:50:08
盐酸胍处理的蛋白经过处理后是可以用来进行SDS-PAGE的,具体做法如下:1份(如50ul)盐酸胍溶解的蛋白和9份(450ul)预冷的无水乙醇,混匀,-20摄氏度静置5min,4℃,13000rpm离心10min,弃上清,然后用1ml预冷的75%的酒精将肉眼可见的蛋白团块重新悬浮起来,-20摄氏度静置5min,4℃,13000rpm离心10min,弃上清,然后用50ul 5×Loading buffer 溶解蛋白团块,剩下来的就剩下煮样跑胶了
爱拼才会赢
2楼2014-05-09 20:25:19
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zhangjie_924

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by anyaxiong at 2014-05-09 20:25:19
盐酸胍处理的蛋白经过处理后是可以用来进行SDS-PAGE的,具体做法如下:1份(如50ul)盐酸胍溶解的蛋白和9份(450ul)预冷的无水乙醇,混匀,-20摄氏度静置5min,4℃,13000rpm离心10min,弃上清,然后用1ml预冷的75%的 ...

您好,还想向您好好学习,咨询一下:我把柱子离心后跑了胶,发现有蛋白,没洗脱干净是一定的,我想知道,洗脱蛋白的洗脱液的配方是怎样的?或者说洗脱液中咪唑的浓度怎样?谢谢谢谢
3楼2014-05-12 10:20:04
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anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

盐酸胍变性的蛋白用含咪唑的buffer洗脱:8M尿素+20至50nM Tris+300至500mM NaCal+500mM咪唑,pH8.0洗脱,洗杂蛋白的buffer可以将咪唑浓度降低,如10/20/50mM咪唑,最后一步用500mM咪唑洗脱目的蛋白。
爱拼才会赢
4楼2014-05-12 18:35:54
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YangKang7057

金虫 (正式写手)

可以先用TCA沉淀蛋白然后再制备样品
5楼2014-06-12 15:02:05
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xuanxuan3240

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by anyaxiong at 2014-05-12 18:35:54
盐酸胍变性的蛋白用含咪唑的buffer洗脱:8M尿素+20至50nM Tris+300至500mM NaCal+500mM咪唑,pH8.0洗脱,洗杂蛋白的buffer可以将咪唑浓度降低,如10/20/50mM咪唑,最后一步用500mM咪唑洗脱目的蛋白。

你好,我想请教您一下,用盐酸胍变性后,需要离心过柱还是直接过柱呢?还有就是盐酸胍变性的时间大概是多少呢?
6楼2016-01-24 19:16:50
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