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louisjackson

金虫 (小有名气)

[求助] 请问我全长基因跑出来之后为什么要小100bp左右呢？ 已有3人参与

我想构建一个目的基因的过表达质粒，在设计目的基因全长引物后跑PCR，结果产物的位置要比实际的小100bp左右，不知道究竟是为什么。内参条带的位置没有什么问题，偏偏是目的基因的产物要小很多。我的全长引物是根据目的基因的CDS序列进行设计的，设计完以后BLAST也没有什么问题，恰恰就是我想要的区间，就是不知为何跑出来却变样了？！求教各位高手了，谢谢！
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
1楼 2014-05-08 22:20:41
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
测序结果如何呢？agarose也没有那么精准，位置稍微有点偏差也比较正常
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2楼2014-05-09 03:43:28
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louisjackson

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by meng_xu at 2014-05-09 03:43:28
测序结果如何呢？agarose也没有那么精准，位置稍微有点偏差也比较正常

昨天全部跑胶了，然后胶回收做上连接了，打算今天重新跑个PCR拿去测序呢！但愿是胶或者marker的问题，这可是构建质粒的关键一步啊！
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
3楼2014-05-09 10:15:53
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meng_xu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by louisjackson at 2014-05-09 10:15:53
昨天全部跑胶了，然后胶回收做上连接了，打算今天重新跑个PCR拿去测序呢！但愿是胶或者marker的问题，这可是构建质粒的关键一步啊！...

关键是看有没有条带，单一与否，构建质粒，之后转化，提取，酶切，看图谱，有时候大小稍微有偏差，测序之后是没有问题的
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4楼2014-05-13 02:13:13
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louisjackson

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by meng_xu at 2014-05-13 02:13:13
关键是看有没有条带，单一与否，构建质粒，之后转化，提取，酶切，看图谱，有时候大小稍微有偏差，测序之后是没有问题的...

你的意思是我这样先构建质粒，对吗？
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
5楼2014-05-13 17:32:16
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906394648

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
louisjackson(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-14 18:13:59
我觉的不是maker的问题，建议你看看最原始的酶切位点，我怀疑不是单一酶切位点
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6楼2014-05-13 19:54:25
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louisjackson

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 906394648 at 2014-05-13 19:54:25
我觉的不是maker的问题，建议你看看最原始的酶切位点，我怀疑不是单一酶切位点

我是跑的全长，还没有酶切呢。
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
7楼2014-05-14 15:51:04
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906394648

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by louisjackson at 2014-05-14 15:51:04
我是跑的全长，还没有酶切呢。...

全长多大呢？你使用的是不是对应的Maker啊？100bp在电泳图上应该不容易看出来的，存在这样的误差
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8楼2014-05-21 16:28:18
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louisjackson

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 906394648 at 2014-05-21 16:28:18
全长多大呢？你使用的是不是对应的Maker啊？100bp在电泳图上应该不容易看出来的，存在这样的误差...

全长804bp。条带在marker 750位置的下面，所以才感觉要小很多。
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It'snotaboutskill,butaboutwill.
9楼2014-05-22 17:17:04
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mehongyu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

最后送去测序，我以前用过不同的loading，迁移也有不同

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10楼2014-05-22 17:39:19
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