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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » DNA含量多少才能在琼脂糖凝胶上显示出亮带
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胡小喜

新虫 (小有名气)

[求助] DNA含量多少才能在琼脂糖凝胶上显示出亮带

想问下各位大虾，DNA要上多少量才能在琼脂糖上显示出亮带啊。看marker中最亮的750bp的dna50ng就很亮了，可是我的总dna用核酸测定仪测出来是110ng/ul，伤了5ul有550ng怎么跑电泳都没见到亮带呢，想问下有哪些因素会影响亮带的显现，另外做过的一般上了多少含量的dna呢，希望各位有经验的大虾指点啊，感激不尽
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1楼2012-11-26 19:17:43
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czdaeq

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助 2012-11-27 16:45:54
scelab: 金币+6, xxjl 2012-11-29 14:03:23
1、核酸检测仪既可以检测DNA也可以检测RNA，不知道楼主的DNA有没有用RNA酶消化呐？
2、一般电泳时，还会加loading dye 并且用量比较随意（严格来看，似乎要求DNA 5 ul：1 ul loading dye），所以电泳跑胶只能大概估计浓度，不知道楼主有么有考虑这点？
3、我们这边用得3K的marker，1、3、5k为亮条带，貌似认为是10ng/ul的量（这个一时也记不太清），所以应该不用太高的浓度就可以看见的，楼主还是看看电泳以前的步骤有么有问题吧
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2楼2012-11-26 20:49:59
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助 2012-11-27 16:51:21
你的DNA的分子量多少？不同大小的DNA上同样量在眼睛看起来亮度是不完全一样的。所以，想要从胶上参照marker定浓度的话，需要参比分子量接近的条带。此外，正如2L说的，RNA的存在会影响DNA的定量。
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3楼2012-11-27 07:23:41
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胡小喜

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by czdaeq at 2012-11-26 20:49:59
1、核酸检测仪既可以检测DNA也可以检测RNA，不知道楼主的DNA有没有用RNA酶消化呐？
2、一般电泳时，还会加loading dye 并且用量比较随意（严格来看，似乎要求DNA 5 ul：1 ul loading dye），所以电泳跑胶只能大概估 ...

用了rna酶的，上次rna酶用的不够，所以跑出来在100bp下面有拖带，后面改进了多加了些，拖带不见了，但是板上什么也没有，整个胶上有弥漫一点一点的小亮点，不知道是怎么回事，拍了照，但是由于像素不高，亮点在照片上显示不出来，我没加样的涌到也出现一些小亮点，不知道是不是缓冲液用久了的原因，但marker是跑出来了，样本dna是总细菌，应该大于2000bp，我有加loadingbuffer的，就是感觉核酸测定仪测了有这么高的dna含量，可就不知道为什么跑不出来，我扩增一次也看不到亮带，第二轮扩增才看到亮带
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4楼2012-11-27 15:19:44
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胡小喜

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-27 07:23:41
你的DNA的分子量多少？不同大小的DNA上同样量在眼睛看起来亮度是不完全一样的。所以，想要从胶上参照marker定浓度的话，需要参比分子量接近的条带。此外，正如2L说的，RNA的存在会影响DNA的定量。

由于是总菌dna，至少在2000bp以上吧，因为我没看到亮带所以也不确定它的分子量，有rna污染的话跑胶时应该在胶上有现象吧
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5楼2012-11-27 15:21:42
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czdaeq

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 胡小喜 at 2012-11-27 15:19:44
用了rna酶的，上次rna酶用的不够，所以跑出来在100bp下面有拖带，后面改进了多加了些，拖带不见了，但是板上什么也没有，整个胶上有弥漫一点一点的小亮点，不知道是怎么回事，拍了照，但是由于像素不高，亮点在照片 ...

不知道，小哥加完RNA酶后有么有再核酸定量一下，若是浓度太低，可能是你PCR or 提的质粒有问题。跟跑胶无关（marker清晰可见的话）
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6楼2012-11-27 16:36:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-28 16:04:16
引用回帖:
5楼: Originally posted by 胡小喜 at 2012-11-27 15:21:42
由于是总菌dna，至少在2000bp以上吧，因为我没看到亮带所以也不确定它的分子量，有rna污染的话跑胶时应该在胶上有现象吧...

菌的总DNA一般是跑到十几K-几十K大小。因为分子量过大，往往亮度反而减弱，要上2ug左右看比较好。RNA污染一般跑在下面。具体什么样在要看样品中RNA的完整性。如果完全不做RNA消化的新鲜样品可以看到23S, 16S，5S的条带。如果做了一定消化或者放置了很久的样品可能在下面出现弥散。
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7楼2012-11-28 08:05:41
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kiruwa

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励分享经验 2012-11-28 16:04:27
你是用nano drop监测DNA浓度的吗？ 现在我们实验室和其他的一些实验室（都在美国）已经再也不用nano drop等靠紫外光定量的DNA浓度测定仪器了。 蛋白质，腐植酸和其他的一些杂质会导致nanodrop给出虚假结果。
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请注意,照片不是我本人!!!请不要把此人和我的长相联系到一起去.
8楼2012-11-28 08:49:37
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kiruwa

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-28 08:05:41
菌的总DNA一般是跑到十几K-几十K大小。因为分子量过大，往往亮度反而减弱，要上2ug左右看比较好。RNA污染一般跑在下面。具体什么样在要看样品中RNA的完整性。如果完全不做RNA消化的新鲜样品可以看到23S, 16S，5S的 ...

是的，RNA会跑到很下面离总DNA比较远的地方，很容易分开。
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请注意,照片不是我本人!!!请不要把此人和我的长相联系到一起去.
9楼2012-11-28 08:50:37
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kiruwa

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
scelab: 金币+6, 谢谢交流 2012-11-28 10:28:23
看了你前面的帖子，发现你们似乎用的是更加老式的机器，那结果就更不可信了。Nanodrop有时会给出特别漂亮的260/280比值，但是一个教授说样品中含有大量蛋白质？？也会给出这样的比值（原话不太记得了，如果有误请谅解）。他们现在跑胶定量（有专门定量分析软件）。我们实验室一般用pico green定量。 另外一个实验室也已经放弃 nanodrop了。
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请注意,照片不是我本人!!!请不要把此人和我的长相联系到一起去.
10楼2012-11-28 08:55:35
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