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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 求助！！！质粒转化一直不成功
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蓝老虎317

银虫 (初入文坛)

[求助] 求助！！！质粒转化一直不成功 已有13人参与

最近质粒转化。是用BL21-DE3做表达。
有一次是一个师兄带着做，这里操作说明一下：（1）取1ul的质粒，然后用100ul的枪将感受态吸出来，打入含有1ul的tube中，吹打三四次，放半小时，(2)热激60s，(3)冰上放2min,(4)直接涂板（备注：这里涂布棒都是酒精灯烧过晾干的），过夜，结果长不出菌落。
前两次是自己做， 步骤大体相类似：(1)我直接将1ul的质粒加入到感受态的tube中（稍融化），没有吹打，只是用枪在感受态中旋转了四五圈，放半小时（2）热激90s，（3）冰上放2min，（4）加不含抗性LB 900ul到tube中，170r/min，1小时；（5）离心12000rp   1min ，去上清液900ul，剩下100ul吹打混匀；（6）涂板，过夜。
这里我和师兄的操作有些许区别：
1、很多同学觉得不加LB摇菌的话，菌可能含量太少，那是不是一定要摇呢？
2、师兄之所以不摇，是因为之前做另一个质粒转化的时候，直接涂，的确长出了单克隆菌。

现在经过好几次的折腾，就是一个菌不长。感受态（借给其他组同学，她加自己的其他10ul质粒，其余步骤和我一样，长出了单克隆菌），抗性（自己用的卡纳和氨苄在其他菌表达的时候都是有效的），质粒质量（老板保证说质粒是没有问题的），可是依然没能长出单克隆菌。
我想问一下还有哪些可能的因素影响质粒的转化。

谢谢各位了！！
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1楼 2014-05-06 11:17:54
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蓝老虎317

银虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-06 12:17:10
检查感受态、平板会不会有问题。
你们实验室制作感受态看起来不是很好啊，去买商业化的感受态吧，不贵。
我们自己制作的感受态，质粒0.2ul+100ul感受态，涂板20ul，就能长很多。质粒直接转化，我们都不加无抗生素 ...

我们是用买来的感受态，牌子是百泰克的。主要是之前借给别的组同学用，他们都转化成功了。长了挺多的
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3楼2014-05-06 12:22:49
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蓝老虎317

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-06 12:26:52
把感受态吸出来？莫非你们把感受态反复冻融了？
我们制作出来的感受态，都是分装成100ul每管，冻在-80度。...

感受态没有反复冻融，我们的感受态也是每个EP管有100ul的，这里吸出来是指将EP管里的感受态打到含有1ul的EP管里，并且吹打。
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7楼2014-05-06 13:01:52
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蓝老虎317

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sakor at 2014-05-06 12:29:35
还是把质粒测个序吧，步骤都没问题

质粒老板说肯定不会有问题。。。另外，我用的所有LB（液体和固体）都是刚配不到一个星期
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8楼2014-05-06 13:02:49
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蓝老虎317

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by meng_xu at 2014-05-06 12:31:59
化学转化有两点很重要
1. 温度，因为感受态是温度敏感，最好保证细胞一直冰浴

2.复苏 如果不复苏，确实也有可以长菌，但是你的效率低，最好还是复苏，因为复苏不光是让菌浓度提高，还是给细胞一个对抗抗性的时间 ...

还是想问一下，你指的复苏是什么意思？   我对这个复苏概念真的不是很清楚
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9楼2014-05-06 13:03:43
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蓝老虎317

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-05-06 18:02:07
1、建议重新做感受态，现做现用那种，下午开始做转化。
2、可以试着多加点质粒（10ul可以试试），加完后用枪头吹匀，注意不要出吹气泡，热激后放冰上5min，注意热激的温度一定是正确的（可以用温度计验证）
3、加 ...

看了您的回复，我有几个问题反馈一下：
1、首先我手头拥有的质粒就只有5ul，所以只能用1ul来做。
2、加LB培养基，您说的是冰浴，我做的时候是把试管里LB液体培养基在37℃预热了，这一步我是不是有问题呢？   是不是应该把试管放在冰水里，不预热，让LB液体培养基保持0℃左右？
3、我之前有离心，转速是5000rpm，1min，余下的是100ul来涂菌；其他组另一个同学，她离心是12000rpm，5min，她有成功。
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12楼2014-05-06 18:46:58
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