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蓝老虎317银虫 (初入文坛)
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[求助]
求助！！！质粒转化一直不成功 已有13人参与
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最近质粒转化。是用BL21-DE3做表达。 有一次是一个师兄带着做，这里操作说明一下：（1）取1ul的质粒，然后用100ul的枪将感受态吸出来，打入含有1ul的tube中，吹打三四次，放半小时，(2)热激60s，(3)冰上放2min,(4)直接涂板（备注：这里涂布棒都是酒精灯烧过晾干的），过夜，结果长不出菌落。 前两次是自己做， 步骤大体相类似：(1)我直接将1ul的质粒加入到感受态的tube中（稍融化），没有吹打，只是用枪在感受态中旋转了四五圈，放半小时（2）热激90s，（3）冰上放2min，（4）加不含抗性LB 900ul到tube中，170r/min，1小时；（5）离心12000rp 1min ，去上清液900ul，剩下100ul吹打混匀；（6）涂板，过夜。 这里我和师兄的操作有些许区别： 1、很多同学觉得不加LB摇菌的话，菌可能含量太少，那是不是一定要摇呢？ 2、师兄之所以不摇，是因为之前做另一个质粒转化的时候，直接涂，的确长出了单克隆菌。 现在经过好几次的折腾，就是一个菌不长。感受态（借给其他组同学，她加自己的其他10ul质粒，其余步骤和我一样，长出了单克隆菌），抗性（自己用的卡纳和氨苄在其他菌表达的时候都是有效的），质粒质量（老板保证说质粒是没有问题的），可是依然没能长出单克隆菌。 我想问一下还有哪些可能的因素影响质粒的转化。 谢谢各位了！！ |
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西门吹雪170
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
蓝老虎317: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-05-06 18:38:04
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蓝老虎317: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-05-06 18:38:04
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1、建议重新做感受态，现做现用那种，下午开始做转化。 2、可以试着多加点质粒（10ul可以试试），加完后用枪头吹匀，注意不要出吹气泡，热激后放冰上5min，注意热激的温度一定是正确的（可以用温度计验证） 3、加培养基要注意提前冰浴好培养基，有助于提高转化效率。然后，放摇床上1h，这有点复性的感觉，建议不要省略这一步 4、离心建议转速不要太大，感受态细胞很脆弱，转速大概5000-6000g，1-2min，弃部分上清，自己感觉一下涂菌的量。一般现做现用的感受态转化效率很高，不需离心就可以涂板了。 |
11楼2014-05-06 18:02:07
2楼2014-05-06 12:17:10
蓝老虎317
银虫 (初入文坛)
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10