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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 单酶切失败。质粒验证显示正确，但是PCR验证与酶切验证出现很多问题，麻烦大家解决下
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ruchang2013

铁虫 (初入文坛)

[求助] 单酶切失败。质粒验证显示正确，但是PCR验证与酶切验证出现很多问题，麻烦大家解决下 已有3人参与

对照为原质粒pTKIP-cat:4kb,上面有单酶切位点ApaI,要插入的核酸片段为2.5kb左右，插入到ApaI位点
1、进行常规质粒提取后，17菌株比对照大，所以将17菌株进行PCR及酶切验证。
2、PCR验证   引物IP1与IP2是原质粒本身有的，galP1与glK2是在核酸片段上。重组成功后PCR验证引物从up到down引物顺序为IP1、glK2（一段碱基片段的下游引物）、galP1（一段碱基片段的上游引物）、IP2
若重组成功IP1/glK2能PCR出1359bp条带，失败无条带；
galP1/IP2：成功能PCR出1741bp条带，失败无条带；
IP1/IP2：成功与核酸片段反接都能PCR出3kb，质粒自连则只能PCR出300bp
3、酶切验证
BglII在核酸片段上，原质粒没有此酶切位点：若成功与核算片段反接，有近7kb条带；质粒自连则4kb条带
ApaI：重组成功后，应该能将核算片段切下，所以又2.5kb与原质粒4kb的条带
4、分析及疑问        常规质粒提取后，17比对照条带明显大，但在后续验证过程中出现疑问：a、每对引物都能PCR出大条带，是质粒本身？但是质粒已经稀释20倍（PCR体系20 μL，质粒加1μL）b、引物IP1/glK2与galP1/IP2 PCR小条带近乎没有；c、引物IP1/IP2能PCR出小条带，与失败一致；c、ApaI酶切，没有小条带出现，显示失败，但是BglII酶切与成功一致。最大可能为反接。
5、测序结果失败，不能测序完整，只测序了一小部分。利用进行核算片段PCR的引物只能测120bp

单酶切失败。质粒验证显示正确，但是PCR验证与酶切验证出现很多问题，麻烦大家解决下
2014.0426 常规检测.png


单酶切失败。质粒验证显示正确，但是PCR验证与酶切验证出现很多问题，麻烦大家解决下-1
2014.0427 17菌PCR酶切.png
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@biostar2009

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1楼 2014-05-04 18:30:54
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为啥不直接做双酶切呢？你用ApnI+BglII切，就知道你的质粒对不对了，不是么？
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4楼2014-05-07 03:30:28
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~春梦秋云~

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ruchang2013: 金币+10, ★有帮助 2014-05-12 14:29:56
个人建议，可以先做菌落PCR，如果p的出来再提质粒酶切验证，还有marker跑的好奇怪，建议可以点两种不同的比较，以检验准确性，至于PCR验证结果那么奇怪，觉得可能是酶切，连接出了问题，有时候切得不对，连的不对也很常见，酶切体系，还有时间都要注意。
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相信黎明不会失约，相信付出必有回报！
2楼2014-05-06 22:14:02
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by ~春梦秋云~ at 2014-05-06 22:14:02
个人建议，可以先做菌落PCR，如果p的出来再提质粒酶切验证，还有marker跑的好奇怪，建议可以点两种不同的比较，以检验准确性，至于PCR验证结果那么奇怪，觉得可能是酶切，连接出了问题，有时候切得不对，连的不对也 ...

质粒电泳受其构象影响。不能简单从跑的比空载大的就认为是有插入。

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3楼2014-05-07 01:31:46
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meng_xu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by meng_xu at 2014-05-07 03:30:28
为啥不直接做双酶切呢？你用ApnI+BglII切，就知道你的质粒对不对了，不是么？

说的可能不够明白，ApnI + BglII 应该给你的3条带，载体,ApnI-BglII, BglII-ApnI，这样你看看大小，3条带，就知道了，如果你要是没提取质粒，你可以PCR验证，已经提取了质粒，再做PCR，没有必要，还浪费时间。
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5楼2014-05-07 03:33:01
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