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ruchang2013铁虫 (初入文坛)
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[求助]
单酶切失败。质粒验证显示正确，但是PCR验证与酶切验证出现很多问题，麻烦大家解决下 已有3人参与
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对照为原质粒pTKIP-cat:4kb,上面有单酶切位点ApaI,要插入的核酸片段为2.5kb左右，插入到ApaI位点 1、进行常规质粒提取后，17菌株比对照大，所以将17菌株进行PCR及酶切验证。 2、PCR验证 引物IP1与IP2是原质粒本身有的，galP1与glK2是在核酸片段上。重组成功后PCR验证引物从up到down引物顺序为IP1、glK2（一段碱基片段的下游引物）、galP1（一段碱基片段的上游引物）、IP2 若重组成功IP1/glK2能PCR出1359bp条带，失败无条带； galP1/IP2：成功能PCR出1741bp条带，失败无条带； IP1/IP2：成功与核酸片段反接都能PCR出3kb，质粒自连则只能PCR出300bp 3、酶切验证 BglII在核酸片段上，原质粒没有此酶切位点：若成功与核算片段反接，有近7kb条带；质粒自连则4kb条带 ApaI：重组成功后，应该能将核算片段切下，所以又2.5kb与原质粒4kb的条带 4、分析及疑问 常规质粒提取后，17比对照条带明显大，但在后续验证过程中出现疑问：a、每对引物都能PCR出大条带，是质粒本身？但是质粒已经稀释20倍（PCR体系20 μL，质粒加1μL）b、引物IP1/glK2与galP1/IP2 PCR小条带近乎没有；c、引物IP1/IP2能PCR出小条带，与失败一致；c、ApaI酶切，没有小条带出现，显示失败，但是BglII酶切与成功一致。最大可能为反接。 5、测序结果失败，不能测序完整，只测序了一小部分。利用进行核算片段PCR的引物只能测120bp  2014.0426 常规检测.png  2014.0427 17菌PCR酶切.png |
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biostar2009
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3楼2014-05-07 01:31:46
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