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水墨蓝

铁虫 (小有名气)

[交流] 空质粒双酶切出现非常相近的两条带?转化长满板?

最近在做原核表达的构建,出现很多以前没见过的情况,各位虫友请帮忙想想什么原因:
1. 空载体约5400 bp,但提取后跑胶显示比15000 bp还要大,单酶切和双酶切后大小和载体实际大小相差不多,这是其一。
2 单酶切和双酶切后均会出现2条非常相近的条带,载体测过序没有问题,而且所选的酶切位点是载体上单一的
3.双酶切 连接转化后涂板,整板长满了菌就像抗性失效一样,后来我涂了不带抗性的菌证明平板抗性没有问题
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唐tjg

版主 (文坛精英)

2楼2014-04-17 13:23:43
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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2楼: Originally posted by 唐tjg at 2014-04-17 13:23:43

你也做这个?@唐tjg
植根于内心的修养;无需提醒的自觉;以约束为前提的自由;为别人着想的善良
3楼2014-04-17 13:50:42
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唐tjg

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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3楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-04-17 13:50:42
你也做这个?唐tjg...

不做,我只是捡金币的,没看见人家不是散金
做一个简单的人,踏实而务实,不沉溺幻想,不庸人自扰……
4楼2014-04-17 14:25:19
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5楼2014-04-17 14:32:34
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落落_无尘

金虫 (初入文坛)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
水墨蓝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-17 16:29:57
可能是你的一部分质粒没切开,所以电泳会有两条带。空质粒的多酶切位点处只有几个碱基,两个酶不容易接近。没切开的质粒转化就很容易长满板了。
6楼2014-04-17 15:19:01
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水墨蓝

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 落落_无尘 at 2014-04-17 15:19:01
可能是你的一部分质粒没切开,所以电泳会有两条带。空质粒的多酶切位点处只有几个碱基,两个酶不容易接近。没切开的质粒转化就很容易长满板了。

我用单个酶分别在通用缓冲液中且,能切出单一条带,但是单酶切的分子量比双酶切的分子量稍稍大些  ps:载体MCS测过序,证明序列没问题
7楼2014-04-17 16:08:11
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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4楼: Originally posted by 唐tjg at 2014-04-17 14:25:19
不做,我只是捡金币的,没看见人家不是散金...

。。。。。在这个版块建议最好发表一下专业见解,帮助人家
植根于内心的修养;无需提醒的自觉;以约束为前提的自由;为别人着想的善良
8楼2014-04-17 16:29:40
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Neo2000

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
很明显,存在不完全酶切的情况

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2014-04-17 16:33:48
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唐tjg

版主 (文坛精英)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-04-17 16:29:40
。。。。。在这个版块建议最好发表一下专业见解,帮助人家...

我是在散金里看见的,就没管那么多
做一个简单的人,踏实而务实,不沉溺幻想,不庸人自扰……
10楼2014-04-17 16:39:50
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