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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

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[求助] pet32a双酶切之后，电泳条带找不到已有3人参与

小弟本科生一枚，最近在构建一种菌，可是经过了两个月的尝试，还是没有成功，愁死了，这个是学校的一个大学生训练项目，搞了这么久还没构建出菌种，我在九月之前还要做出目的蛋白的表达，对表达蛋白的性质做出研究，才能结题，现在是愁死了，求告各位大侠给予意见。
首先，我用的是X-hol和BamHI这两个酶，目的基因在2700左右，目的基因在经过PCR之后，做37度双酶切6h能跑出目的条带。这个是确定的。但是在双酶切32a质粒之后，确实无论如何也跑不出条带。后来又做了单酶切切pet-32a质粒，但是3h之后，依旧是没有任何条带出现。（声明：32a未经酶切的质粒是跑得出来的。）今日又做了分小时单酶切，做法是每半小时去一次37度酶切样品，迅速放入65度烘箱中使其中的酶失活，共切了两个小时，却还是没有跑出任何条带，这不应该啊，刚加入酶就取样的也没跑出来，这太不合理了吧！（取样：2微升跑胶。）今天的除了没有酶切过的质粒跑出来了非常明显的条带，其余的都没跑出来，是跑胶打样太少了么？
双酶切体系：50微升
10Xbuffer tango 10微升
BamHi                2微升
X-hol                   2微升
pet-32a质粒                   36微升（有时质粒浓度高的话也会用25微升质粒加11微升ddH2O）
37度水浴6h
单酶切体系：20微升
buffer tango    4微升
BamHI             0.5微升
32a质粒       10微升
ddH2O          5.5微升

单酶切体系：20微升
buffer tango 4微升
X-hol             0.5微升
32a质粒       10微升
ddH2O          5.5微升

另外，跑胶电压是100V 时间是40分钟这个应该不会有什么问题吧？

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