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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因扩不出来
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)

[求助] 基因扩不出来 已有4人参与

我有紫花苜蓿某个基因一段不完整的序列，blast结果显示蒺藜苜蓿与它同源性较高，为98%。根据蒺藜苜蓿完整的mRNA（大小为3310bp）设计引物，以紫花苜蓿的cDNA为模板，为什么扩不出来目的片段？
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在学术的汪洋里，扑腾。
1楼 2014-03-03 16:24:26
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-03-04 08:42:12
赵晓楠zxn: 金币+3, ★有帮助 2014-03-04 09:50:55
1、RNA抽的不好
2、引物设计的不好
3、实验操作技能可能存在问题
4、降低退火温度试试
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
2楼2014-03-03 19:02:01
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-03-04 08:42:15
赵晓楠zxn: 金币+3 2014-03-04 09:51:04
确定一下该基因表大么？再一个根据保守区段多设计几对引物，一定不要再UTR区域设计那地差异太大。
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hehe
3楼2014-03-03 20:19:35
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acer_hp

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-03-04 08:42:19
赵晓楠zxn: 金币+3, ★有帮助 2014-03-04 09:51:20
是不是太长了不好扩，要不换一种专门扩增长片段的酶，或者分两段扩增。
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4楼2014-03-03 21:52:12
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-03-03 19:02:01
1、RNA抽的不好
2、引物设计的不好
3、实验操作技能可能存在问题
4、降低退火温度试试

用同样的的模板扩过其他基因，能扩出来。至于引物，用过四对，出现过比它小1000bp的片段，其他引物都只产生了引物二聚体。退火温度，也试着降低过，仍旧扩不出来。ps:这个基因表达量不高，但是不至于扩不出来吧。
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5楼2014-03-04 09:34:48
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by acer_hp at 2014-03-03 21:52:12
是不是太长了不好扩，要不换一种专门扩增长片段的酶，或者分两段扩增。

换过高效率的酶，仍旧没结果。但是分两段怎么扩增，不是很明白。求指点。。。
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在学术的汪洋里，扑腾。
6楼2014-03-04 09:37:13
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赵晓楠zxn

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-03 20:19:35
确定一下该基因表大么？再一个根据保守区段多设计几对引物，一定不要再UTR区域设计那地差异太大。

我后续是想做该基因在紫花苜蓿上过表达，现在首先是验证一下紫花苜蓿上是否有该基因。
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7楼2014-03-04 09:48:30
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liuaynbin007
祝福
8楼2014-03-04 09:52:19
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 01:41:57
引用回帖:
5楼: Originally posted by 赵晓楠zxn at 2014-03-04 09:34:48
用同样的的模板扩过其他基因，能扩出来。至于引物，用过四对，出现过比它小1000bp的片段，其他引物都只产生了引物二聚体。退火温度，也试着降低过，仍旧扩不出来。ps:这个基因表达量不高，但是不至于扩不出来吧。...

根据你的描述，你扩增的片段一定很大吧？有用过LA Taq吗？这个酶是扩增长片段专用的，虽然说扩增出你目的基因的几率还是有点低，也可以试试看。感觉模板中含有你这个基因的可能性比较低，所以才可能导致扩不出来，建议问问老师或者师兄师姐
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
9楼2014-03-04 10:14:16
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haizhiye

木虫 (小有名气)
各位都是这方面的高手啊，初来乍到，希望各位多多的指导，你们太厉害了！
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青春是我们舞动的财富
10楼2014-03-04 11:03:35
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