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lumingyang

金虫 (初入文坛)

[求助] 求助:大豆基因组3000bpDNA扩增,P不出来

大豆基因组DNA,欲扩增3K目标基因,先拿Taq试PCR温度和其他条件,拿别人设计的目标产物是1K左右的引物作为对照,55-62度梯度PCR。结果是5的温度梯度对照(1K)都P出来了,我的三对引物都木有P出来。20的体系:10umol的左右引物各5,模板2,dNTP 2, Taq 0.2 ,Buffer 2, ddH2O 13.4.  PCR:94 4min; 94 30sec, 60 30sec, 72 3min, 35cycles; 72 10min; 25 forever.求大神分析接下来该怎么改进,怎么才能P出来
求助:大豆基因组3000bpDNA扩增,P不出来
梯度PCR-5.5.jpg
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孙小爽

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
lumingyang(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-06-07 08:55:40
降低退火温度再试一下,或是重新设计引物。
2楼2013-06-05 22:47:05
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天水秋林

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

体系应该没有什么问题   操作没有什么失误的话  我认为还是引物的问题   建议检查一下  或重新设计
3楼2013-06-28 22:20:19
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖


kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-29 12:10:30
1,都用引物二聚体,可以热处理减少二聚体2,扩增的片段,可以选用扩增效率高一点的exTaq酶
3,设计引物所选择的序列是否正确?非特异性扩增条带多说明引物不够特异,引物可以长一点。3‘端要保守,并且最好不要是A..
4楼2013-06-28 23:29:35
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孙小爽

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以增加循环数看一下,但最高应该到40吧,增加模版浓度,实在不行应该就是引物问题了。
5楼2013-08-29 08:38:18
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