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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：大豆基因组3000bpDNA扩增，P不出来
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lumingyang

金虫 (初入文坛)

[求助] 求助：大豆基因组3000bpDNA扩增，P不出来

大豆基因组DNA，欲扩增3K目标基因，先拿Taq试PCR温度和其他条件，拿别人设计的目标产物是1K左右的引物作为对照，55-62度梯度PCR。结果是5的温度梯度对照（1K）都P出来了，我的三对引物都木有P出来。20的体系：10umol的左右引物各5，模板2，dNTP 2， Taq 0.2 ，Buffer 2， ddH2O 13.4.  PCR：94 4min; 94 30sec, 60 30sec, 72 3min, 35cycles; 72 10min; 25 forever.求大神分析接下来该怎么改进，怎么才能P出来
求助：大豆基因组3000bpDNA扩增，P不出来
梯度PCR-5.5.jpg
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1楼 2013-06-05 22:12:48
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孙小爽

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以增加循环数看一下，但最高应该到40吧，增加模版浓度，实在不行应该就是引物问题了。
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5楼2013-08-29 08:38:18
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孙小爽

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lumingyang(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-07 08:55:40
降低退火温度再试一下，或是重新设计引物。
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2楼2013-06-05 22:47:05
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天水秋林

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

体系应该没有什么问题   操作没有什么失误的话  我认为还是引物的问题   建议检查一下  或重新设计
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3楼2013-06-28 22:20:19
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-29 12:10:30
1,都用引物二聚体，可以热处理减少二聚体2，扩增的片段，可以选用扩增效率高一点的exTaq酶
3，设计引物所选择的序列是否正确？非特异性扩增条带多说明引物不够特异，引物可以长一点。3‘端要保守，并且最好不要是A..
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4楼2013-06-28 23:29:35
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