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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接效率低，重组质粒无法酶切
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sylar731

新虫 (初入文坛)

[求助] 连接效率低，重组质粒无法酶切 已有1人参与

求助各位，本人最近克隆十分不顺利，T载体自连情况严重，转化后白斑很少，全是蓝色和淡蓝色菌落，挑选五个菌落，三个白色和两个淡蓝色，质粒小提后酶切检测，兰斑倒是能切开，但无法理解白斑无法酶切，T载体为实验室自制，载体上有一个酶切位点。以前实验要么是切不对，就是没插入目的片段，要么是一条带，没有插入片段。但最近经常出现这种无法酶切的情况，不知哪里出了问题，恳请各位大牛帮忙分析分析！小弟不胜感激！
下图中Marker为Thermo 10kb ladder，条带依次为三个白斑和两个淡蓝斑，Thermo 普通限制酶 ApaI，10ul体系，37度酶切4小时。
连接效率低，重组质粒无法酶切
1.jpg
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1楼 2014-02-14 12:00:58
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sylar731: 金币+5, ★有帮助 2014-02-14 16:33:04
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-14 16:58:41
估计是你们载体出问题。建议你们选测序好的载体，单克隆大提质粒做载体，这样保证载体一致。没必要非用自制的T载体，你选商业化的也便宜。
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hehe
2楼2014-02-14 15:30:00
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sylar731

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-02-14 15:30:00
估计是你们载体出问题。建议你们选测序好的载体，单克隆大提质粒做载体，这样保证载体一致。没必要非用自制的T载体，你选商业化的也便宜。

非常感谢！不过我还想请教一下，载体会是多克隆位点部分的问题吗？之前测序是正确的，菌液传代会使载体突变吗？现在我每次载体都只做一点，担心保存不当，末端的T会降解。时好时坏，很不稳定，有时要好几次连接才能筛到阳性克隆，太郁闷了。
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3楼2014-02-14 16:31:58
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l68266152

银虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-02-15 17:01:26
连接用的质粒最好是新鲜提取酶切的，我们实验室之前出这个问题，最后证明是引物合成错误，虽然是个偶然，但可供你参考，
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相信自己
4楼2014-02-14 21:08:47
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sylar731

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-14 21:08:47
连接用的质粒最好是新鲜提取酶切的，我们实验室之前出这个问题，最后证明是引物合成错误，虽然是个偶然，但可供你参考，

非常感谢，还想请教下你们后来发现引物出了什么问题呢，我测序时发现过没有加上酶切位点的情况，重新合成引物克隆测序还是没有。

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5楼2014-02-15 11:08:24
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l68266152

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sylar731 at 2014-02-15 11:08:24
非常感谢，还想请教下你们后来发现引物出了什么问题呢，我测序时发现过没有加上酶切位点的情况，重新合成引物克隆测序还是没有。
...

引物公司把酶切位点合成错误了
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相信自己
6楼2014-02-15 13:20:07
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