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皇猪木虫 (正式写手)
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[求助]
基因克隆流程 已有1人参与
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春节来了，本人给大家先拜个年，祝大家马年马上有车，马上有房，马上有对象，马上有金山。。。。。。 各位学者， 本人最近需要对100bp左右的PCR扩增产物测序，按照测序公司的要求，做了基因克隆，第一次做克隆吧，测序出来的结果显示 序列有920bp，远大于我的目的片段，而且测出的序列也不是我需要的，因年底从实验室回家了，这个问题还没有进行多深的探讨，想在小木虫 论坛上咨询咨询做过克隆测序的前辈，为了实现测序目的该怎么做基因克隆，具体流程怎样？？？？ 再次向大家拜年，祝大家新年快乐，阖家欢乐！！！ |
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皇猪
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7楼2014-02-02 13:20:09
Lau_Kimura
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最简单的TA克隆（Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A） Taq酶PCR，电泳检测产物特异性（如有必要，切胶回收），异丙醇沉淀纯化； 连接：Takara 的 pMD 18-T Vector试剂盒； 电击转化：取1-1.5微升重组质粒，40微升分装的E.coli感受态，1100V，200欧姆（1mm电击杯）； 涂板：2倍YT培养基（1mL）复苏30min后，取100微升涂布抗性筛选平板； 摇菌：挑取单菌落加入抗性LB培养基中，摇菌过夜； PCR检测：粗提质粒（200微升沉淀，加50微升水重悬浮，95度7分钟裂解，离心取2微升上清做模版）。 提质粒，消化RNA，送测序即可。 |
2楼2014-01-29 23:32:55
bujunyang
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卓尔不群
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| 建议你还是先了解一下测序原理。一个测序反应一般可以测800到1000bp。测序的结果，前边的几十个碱基和最后的几十个碱基是测不准确的，所以测序公司会建议把DNA片段连接到一个载体上去，测序反应从载体开始，这样就可以保证你的序列不会落到最前面的几十个碱基中。你需要做的是做连接和转化，挑选正确的克隆送去测序，然后从返回的结果中找到你的序列。 |
3楼2014-01-30 00:16:21
4楼2014-01-31 00:59:09
