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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

[交流] 做共表达，用什么克隆方法比较好呢？

最近准备做共表达，需要将多个基因克隆入一个载体中进行共表达。
现在有以下方法可供选择：
1、传统的酶切连接方法：通过多次酶切连接操作，容易理解，但操作繁琐。
2、LIC
3、SLIC
4、Gibson
5、CPEC
6、OE-PCR克隆

其中，后面几种方法总体差不多，但具体策略不是太一样，不知道具体用什么方法好？
有没有比较详细点的综述文章对这几个方法进行比较？
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1楼 2013-02-21 21:32:08
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★
snoopyzxx(金币+1): 谢谢参与
2我不知道你指的具体步骤是什么

SliC和Gibson很像，但是效率低不少，gibson已经有试剂盒卖了，如果舍得花钱倒是很方便
6和5没有本质区别，我自己做3,4,5时候也都习惯P成两个大片段最后再成环，效率高点
我能感觉到的区别就是PCR方法有时候在连接处会多一些碱基（各种原因），SliC和Gibson如果有个片段比较小得话需要重新考虑步骤。
综述还没有吧，有几个方法还在优化
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3楼2013-02-21 22:09:41
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-02-21 22:09:41
2我不知道你指的具体步骤是什么

SliC和Gibson很像，但是效率低不少，gibson已经有试剂盒卖了，如果舍得花钱倒是很方便
6和5没有本质区别，我自己做3,4,5时候也都习惯P成两个大片段最后再成环，效率高点
我能感 ...

为什么会多碱基呢？引物设计的原因还是错误位置退火的原因？
如果是多个基因连到一个载体的话，用cpec或OEpcr效率应该比常规酶切连接高很多，因为都需要设计引物，都需要PCR。而cpec方法可以在PCR的同时完成连接反应。
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547star
4楼2013-02-21 22:24:24
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
多片段fusionPcr没问题，成环还是算了。多碱基反正是各种原因，有些比较诡异，不过一般多挑两克隆就行，比较麻烦的是末端有重复序列

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2013-02-21 22:31:05
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30937747

木虫 (小有名气)
★
snoopyzxx(金币+1): 谢谢参与
有一种方法，叫Red/ET，一次性连两个基因的可以用三重同源重组
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6楼2013-02-22 16:32:31
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547star

木虫 (著名写手)
★
snoopyzxx(金币+1): 谢谢参与
踩一下,留个记号.也发现过末端重复序列,是引物反向重复的.
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7楼2013-02-22 16:33:16
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-02-21 22:31:05
多片段fusionPcr没问题，成环还是算了。多碱基反正是各种原因，有些比较诡异，不过一般多挑两克隆就行，比较麻烦的是末端有重复序列

其实做克隆表达的话，3‘端有重复序列也没问题吧？反正目的基因后面是要加终止密码子的。后面随便什么序列都可以。
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8楼2013-02-22 18:47:40
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
一般是需要引入promoter时，很多promoter的结合activator或者repressor序列都不是一段，就会出问题，当然有些情况下要完全避免这问题只能选择BsaI那种酶来处理。
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9楼2013-02-22 21:49:01
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-02-22 21:49:01
一般是需要引入promoter时，很多promoter的结合activator或者repressor序列都不是一段，就会出问题，当然有些情况下要完全避免这问题只能选择BsaI那种酶来处理。

能详细说说吗？或者有没有相关文献？
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10楼2013-02-22 22:00:20
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547star

木虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by snoopyzxx at 2013-02-21 22:24:24
为什么会多碱基呢？引物设计的原因还是错误位置退火的原因？
如果是多个基因连到一个载体的话，用cpec或OEpcr效率应该比常规酶切连接高很多，因为都需要设计引物，都需要PCR。而cpec方法可以在PCR的同时完成连接反 ...

我也是这么想的，相比其他各种克隆方法，CPEC的优势之一就是在PCR过程中间的时候，加点载体片段，就可能可以直接用PCR产物转化得到克隆，没有额外的试剂和时间消耗，费用少。但我还没有试，不知道你做了在PCR同时完成连接反应的克隆没有，效果如何？
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11楼2013-09-04 20:08:09
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veterinary

金虫 (小有名气)
★
snoopyzxx(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
3楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-02-21 22:09:41
2我不知道你指的具体步骤是什么

SliC和Gibson很像，但是效率低不少，gibson已经有试剂盒卖了，如果舍得花钱倒是很方便
6和5没有本质区别，我自己做3,4,5时候也都习惯P成两个大片段最后再成环，效率高点
我能感 ...

请问，如果有小片段需要怎么改变方法啊？

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12楼2016-01-24 23:57:06
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1272356152

新虫 (正式写手)
★
snoopyzxx(金币+1): 谢谢参与
cpec是什么方法啊

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13楼2016-01-25 00:02:27
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yingying15882楼
2013-02-21 22:05   回复  
snoopyzxx(金币+1): 谢谢参与
梦想天行14楼
2016-11-16 22:39   回复  
snoopyzxx(金币+1): 谢谢参与
， 发自小木虫Android客户端
梦想天行15楼
2016-11-16 22:42   回复  
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