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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因克隆流程
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皇猪

木虫 (正式写手)

[求助] 基因克隆流程 已有1人参与

春节来了，本人给大家先拜个年，祝大家马年马上有车，马上有房，马上有对象，马上有金山。。。。。。


   各位学者，
  
         本人最近需要对100bp左右的PCR扩增产物测序，按照测序公司的要求，做了基因克隆，第一次做克隆吧，测序出来的结果显示
序列有920bp，远大于我的目的片段，而且测出的序列也不是我需要的，因年底从实验室回家了，这个问题还没有进行多深的探讨，想在小木虫
论坛上咨询咨询做过克隆测序的前辈，为了实现测序目的该怎么做基因克隆，具体流程怎样？？？？

     再次向大家拜年，祝大家新年快乐，阖家欢乐！！！
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没有梦想，那跟咸鱼有什么分别
1楼 2014-01-29 21:14:01
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547star

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-02-02 09:47:53
可能你的100bp因为太靠近测序引物，没测出来，或者就在900多bp的测序结果中，只是你没认真分析找出来。
赞一下(1人) 回复此楼
为什么
4楼2014-01-31 00:59:09
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2014-01-30 08:03:17
皇猪: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-02-01 22:43:12
皇猪: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-02-02 13:21:04
最简单的TA克隆（Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A）

Taq酶PCR，电泳检测产物特异性（如有必要，切胶回收），异丙醇沉淀纯化；

连接：Takara 的 pMD 18-T Vector试剂盒；

电击转化：取1-1.5微升重组质粒，40微升分装的E.coli感受态，1100V，200欧姆（1mm电击杯）；

涂板：2倍YT培养基（1mL）复苏30min后，取100微升涂布抗性筛选平板；

摇菌：挑取单菌落加入抗性LB培养基中，摇菌过夜；

PCR检测：粗提质粒（200微升沉淀，加50微升水重悬浮，95度7分钟裂解，离心取2微升上清做模版）。

提质粒，消化RNA，送测序即可。
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2楼2014-01-29 23:32:55
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bujunyang

木虫 (正式写手)

卓尔不群

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2014-01-30 08:03:22
皇猪: 金币+3 2014-02-01 22:43:16
皇猪: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-02-02 13:20:28
建议你还是先了解一下测序原理。一个测序反应一般可以测800到1000bp。测序的结果，前边的几十个碱基和最后的几十个碱基是测不准确的，所以测序公司会建议把DNA片段连接到一个载体上去，测序反应从载体开始，这样就可以保证你的序列不会落到最前面的几十个碱基中。你需要做的是做连接和转化，挑选正确的克隆送去测序，然后从返回的结果中找到你的序列。
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来是偶然，去是必然。
3楼2014-01-30 00:16:21
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mao081312

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
皇猪: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-02-02 13:20:18
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-02-04 18:43:29
你pcr扩增时跑电泳验证大小是100bp左右么？你送测序的样品是pcr未纯化，还是连上了克隆载体的呢？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2014-02-02 08:21:43
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