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love犬夜叉

木虫 (小有名气)

[求助] 关于T载连接的相关问题 已有2人参与

我是用的宝生物的Ex-TAq酶做的PCR,Ex-TAq酶可以在PCR反应产物后面加上A么?之前我做过几次,有几次没有长,我是按照说明书上连接的是30min,后来做了一次对照,即一个30min,一个连接过夜,结果连接30min的长了,过夜的反而没长,可是提取质粒的时候总是提不出来,不知道是什么原因。求大神指点!
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justloveinuyasha
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-01-10 23:19:32
love犬夜叉: 金币+3, 有帮助 2014-01-13 12:52:49
Ex-TAq可以在后面加A,你提质粒前菌落PCR结果好吗?有很多菌落会出现假阳性。T-载体我们一般16度联2个小时用的TAKALA pMD18-T。
hehe
2楼2014-01-10 20:59:14
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luzhouyue

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2014-01-10 23:19:44
love犬夜叉: 金币+2, 有帮助 2014-01-13 12:53:00
会带A的,你时间应该不够,我们都是晚上连接,第二天下午做转化
3楼2014-01-10 21:59:17
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love犬夜叉

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-10 20:59:14
Ex-TAq可以在后面加A,你提质粒前菌落PCR结果好吗?有很多菌落会出现假阳性。T-载体我们一般16度联2个小时用的TAKALA pMD18-T。

没有做过菌落PCR,我是用的19-t,是连的时间不够么?感受态细胞会不会有影响?
justloveinuyasha
4楼2014-01-11 11:36:13
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love犬夜叉

木虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by luzhouyue at 2014-01-10 21:59:17
会带A的,你时间应该不够,我们都是晚上连接,第二天下午做转化

但说明书上说30min就够了啊·······过夜的话时间是不是太长了些?
justloveinuyasha
5楼2014-01-11 11:36:59
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by love犬夜叉 at 2014-01-11 11:36:13
没有做过菌落PCR,我是用的19-t,是连的时间不够么?感受态细胞会不会有影响?...

你怎么验证是阳性菌的,蓝白斑筛选?建议你做个菌落PCR,确定阳性菌。理论上连接时间足够了。你可以稍微延长些。感受态有没有问题,你可以加个对照看看。
hehe
6楼2014-01-11 11:45:07
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love犬夜叉

木虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-11 11:45:07
你怎么验证是阳性菌的,蓝白斑筛选?建议你做个菌落PCR,确定阳性菌。理论上连接时间足够了。你可以稍微延长些。感受态有没有问题,你可以加个对照看看。...

嗯,我是用的蓝白斑筛选··
justloveinuyasha
7楼2014-01-12 12:05:33
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luzhouyue

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by love犬夜叉 at 2014-01-11 11:36:59
但说明书上说30min就够了啊·······过夜的话时间是不是太长了些?...

连接时间长点没什么关系吧
8楼2014-01-12 21:59:20
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