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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于PCR的基础问题
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a770992409

新虫 (小有名气)

[求助] 关于PCR的基础问题 已有4人参与

请教一下：1.PCR中引物是不是不能和poly A的模板结合？如果用的是taq 酶，poly A模板的AAAA……A会不会被切掉？
                  2.如果参考文献的方法要得到的双链不一样长（类似于有粘性末端），怎么证明我得到了这样双链产物？
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1楼 2014-01-05 15:18:43
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a770992409

新虫 (小有名气)
只有机器人回答我的帖子吗，好凄凉
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2楼2014-01-05 16:05:59
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-05 18:43:50
1. 如果你设计引物为oligoT，就可以与polyA模板结合了。没听说Taq酶有外切功能。
2. 好像没有听说可以得到不一样的长的双链。除非你只做一个循环。
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3楼2014-01-05 18:04:59
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gyl121

新虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-07 10:28:17
楼主啊，你这个问题有点不太明了
1.poly A模板没有这个吧，在DNA中有AAAAA的序列的话，你可以配对的设计，但是必然会形成引物二聚体的
   同时，POLYA是后期加上去的，如果你是用CDNA，那你是去掉这个结构的
2.如果双链不一样长，那个在DNA中也是看不到的，因为扩出来最多的是两引物的重复片段，所以不会出现，怎么样判定，我觉得你设计引物时将片段包括进去就可，酶切
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不经一番寒彻骨，怎得梅花扑鼻香？为科学进步不懈努力
4楼2014-01-05 21:04:42
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m602010145

新虫 (初入文坛)
这个问题太2
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时间无法为你停留，但你可以追上时间的脚步。
5楼2014-01-06 13:24:26
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a770992409

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-05 18:04:59
1. 如果你设计引物为oligoT，就可以与polyA模板结合了。没听说Taq酶有外切功能。
2. 好像没有听说可以得到不一样的长的双链。除非你只做一个循环。

1.你的意思是说如果模板是polyA，是可以被扩增出来的？我周围的人告诉我taq酶不能和AAA这样的序列结合，所以有此疑问
2.就先假定有方法可以得到，那么怎么证明得到了？我现在用的是做变性的DNA电泳，如果得到的是两条带，就认为链长是不一样的。但是实际这么做了以后发现还是有问题。
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6楼2014-01-07 01:31:27
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a770992409

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyl121 at 2014-01-05 21:04:42
楼主啊，你这个问题有点不太明了
1.poly A模板没有这个吧，在DNA中有AAAAA的序列的话，你可以配对的设计，但是必然会形成引物二聚体的
   同时，POLYA是后期加上去的，如果你是用CDNA，那你是去掉这个结构的
2.如 ...

1.没用cDNA，请问这样为什么会形成引物二聚体？
2.意思不是模板的链长不一样，而是类似于用PCR的方法给等长的双链模板加上粘性末端，这其中很重要的是同利用PCR的扩增效果得到很多这样的产物，可以理解为两步合并为一步吧
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7楼2014-01-07 01:36:18
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a770992409

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by m602010145 at 2014-01-06 13:24:26
这个问题太2

104除以2等于多少？这么2的问题你怎么回答不出来？
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8楼2014-01-07 01:38:05
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
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有几个问题：
1. “poly A的模板”是什么样的模板？

2. 如果参考文献的方法要得到的双链不一样长（类似于有粘性末端），具体什么意思，是通过PCR获得吗？还是其他方法？能否具体的举个例子？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
9楼2014-01-07 10:31:30
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gyl121

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by a770992409 at 2014-01-07 01:36:18
1.没用cDNA，请问这样为什么会形成引物二聚体？
2.意思不是模板的链长不一样，而是类似于用PCR的方法给等长的双链模板加上粘性末端，这其中很重要的是同利用PCR的扩增效果得到很多这样的产物，可以理解为两步合并 ...

楼主，你好，大致懂你的意思了
首先，表示抱歉，不一定完全形成二聚体，但是有极大的可能性的，因为你是一连串的相同碱基，总之，会有很大的影响，可以参见引物设计要求
   其次，你要给双链加上若干粘性模板的状况，当然不等长，设计引物也可以，但就是不知道稳定性如何，效果如何（因为没有试过，不便评论）你可以先试试，效果不好的话，我的建议是你可以酶位点的那些碱基，到时把他们减掉就好，这样可以得到的你的两步了，记得你序列长度，看条带先大致判断，做下一步时就明了了，祝好吧
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不经一番寒彻骨，怎得梅花扑鼻香？为科学进步不懈努力
10楼2014-01-07 11:12:15
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