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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反转录的cDNA没问题，但是实时定量PCR却不行。内参扩不出来啊。
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再见萤火虫89

银虫 (小有名气)

[求助] 反转录的cDNA没问题，但是实时定量PCR却不行。内参扩不出来啊。 已有4人参与

反转录RNA，用得到的cDNA做了实时定量。cDNA的浓度结果都可以，260/280约为1.8，260/230约为2.2~2.38，浓度为1300~1500ng/ul.测浓度时的峰值也正常，只有260nm处有峰。但是，问题是，有的cDNA能正常扩增出内参基因，有的扩不出来。补充一下，内参没问题。这是什么原因啊？怎么解决啊？前辈们，请教。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

[ Last edited by 再见萤火虫89 on 2013-12-26 at 14:46 ]
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天助自助者。最喜欢的动画片之一《再见萤火虫》，又名《萤火虫之墓》
1楼 2013-12-26 13:03:14
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

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以什么为内参？目的基因能扩增出来吗？
扩增出来的说不定是基因组DNA污染的样品
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8楼2013-12-28 12:24:44
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再见萤火虫89

银虫 (小有名气)
有没有大牛帮帮忙啊，很急啊。
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天助自助者。最喜欢的动画片之一《再见萤火虫》，又名《萤火虫之墓》
2楼2013-12-26 14:47:54
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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再见萤火虫89: 金币+5, ★有帮助 2013-12-26 15:43:12
"cDNA的浓度结果都可以，260/280约为1.8~1.9，260/230约为2.2~2.3，浓度为1300~1500ng/ul.测浓度时的峰值也正常，只有260nm处有峰。"
一般是不测定cDNA浓度的，即使你测出值来也是不准确的，没有参考意义
cDNA的好坏取决于你做逆转录时的模板的质量和逆转录的过程，一般我们控制RNA的质量，判定RNA的浓度，纯度和完整度后不同样本取同量RNA做逆转录得到cDNA，然后再去等量cDNA去做realtime

现在你的问题是，有的cDNA能正常扩增出内参基因，有的扩不出来，我觉得可能还是你的扩不出来的那些样品的RNA提取的有问题，你可以check一下RNA，后再做判断
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-12-26 14:50:24
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再见萤火虫89

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-26 14:50:24
"cDNA的浓度结果都可以，260/280约为1.8~1.9，260/230约为2.2~2.3，浓度为1300~1500ng/ul.测浓度时的峰值也正常，只有260nm处有峰。"
一般是不测定cDNA浓度的，即使你测出值来也是不准确的，没有参考意义 ...

但是，部分能扩出内参的RNA的质量比扩不出内参的RNA 质量还差啊。评判RNA质量主要是看电泳结果是吧，不是看260/280神马的吧。
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天助自助者。最喜欢的动画片之一《再见萤火虫》，又名《萤火虫之墓》
4楼2013-12-26 15:43:00
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