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sophia-yxh

铜虫 (正式写手)


[交流] 关于大肠杆菌表达目标蛋白问题

最近几批的发酵过程中发现,发酵所得的目标蛋白的260的吸光度接近是280时的3倍,可以判定里面几乎全部是核酸,目标蛋白很少了。

后来我查阅资料发现我们添加的tryptone和酵母粉(OXOID)中氨基酸成分有几种是没有的,而恰巧我们目标蛋白中是需要的。我和领导说了这一情况,但是他说大肠杆菌是可以合成各种氨基酸的,不会影响目标蛋白的合成的。我有点疑惑的是,在翻译的时候,由于比较快速而造成大肠杆菌合成这些氨基酸的速度慢,而导致目标蛋白没有合成成功呢?  他说不会的,我的想法是不是很幼稚啊?  而且他一直说发酵没有问题,是纯化和复性的问题。
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


★ ★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助! 2014-01-14 23:06:21
会不会是你的目标蛋白结合核酸?你可以试试用核酸酶处理样品后再纯化,看结果如何。
2楼2013-12-23 11:54:00
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fakebook

木虫 (文坛精英)



sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
愿楼主心想事成
4楼2013-12-23 12:22:20
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heibi

金虫 (文坛精英)



sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
深深祝福
5楼2013-12-23 12:22:23
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niu.bi

木虫 (文坛精英)



sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
Good luck
6楼2013-12-23 12:22:26
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b729

金虫 (文坛精英)



sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
愿楼主心想事成
7楼2013-12-23 12:23:20
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seeforme

新虫 (知名作家)



sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
Good luck
8楼2013-12-23 12:23:21
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wendy3

金虫 (文坛精英)



sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
祝福楼主
10楼2013-12-23 12:24:33
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匿名

用户注销 (正式写手)



sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
本帖仅楼主可见
13楼2013-12-23 14:21:59
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181587941

金虫 (正式写手)


★ ★ ★ ★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
laozuzunzhe: 金币+3, good! 2014-01-14 23:06:30
你领导说的有一定道理,因为高密度发酵时,很多培养基配方都不含酵母粉和蛋白胨的,表达也很好啊。但是不可否认有些时候加入氨基酸可以提高表达量。具体的要做实验证明的,理论毕竟是理论,谁说了都不一定对,数据说明一切。另外,靠260和280不能说明你的表达情况好坏,应该通过电泳、ELISA等手段,数据才比较有说服力。
14楼2013-12-23 15:52:01
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sophia-yxh

铜虫 (正式写手)


引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-23 11:54:00
会不会是你的目标蛋白结合核酸?你可以试试用核酸酶处理样品后再纯化,看结果如何。

是复性好后用核酸酶处理吗?

[ 发自小木虫客户端 ]
15楼2013-12-24 08:26:25
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sophia-yxh

铜虫 (正式写手)


引用回帖:
14楼: Originally posted by 181587941 at 2013-12-23 15:52:01
你领导说的有一定道理,因为高密度发酵时,很多培养基配方都不含酵母粉和蛋白胨的,表达也很好啊。但是不可否认有些时候加入氨基酸可以提高表达量。具体的要做实验证明的,理论毕竟是理论,谁说了都不一定对,数据说 ...

电泳条带显示目标蛋白很少,几乎没有,也跑了琼脂糖核酸电泳,也没看到有核酸,奇怪这溶液里面是什么捏??

[ 发自小木虫客户端 ]
16楼2013-12-24 08:29:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


引用回帖:
15楼: Originally posted by sophia-yxh at 2013-12-24 08:26:25
是复性好后用核酸酶处理吗?
...

任何时候,只要体系大致满足核酸酶的缓冲和离子条件。
17楼2013-12-24 08:50:10
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sophia-yxh

铜虫 (正式写手)


引用回帖:
17楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-24 08:50:10
任何时候,只要体系大致满足核酸酶的缓冲和离子条件。...

透析复性好的蛋白要上Q柱进行层析的,若加入核酸酶会不会影响蛋白的柱行为呢?

还有目标的pi是4.8,我们用的缓冲液的pH8.0,但在这个条件下,有的时候还是挂不上柱子,这是怎么回事呢?
18楼2013-12-24 09:33:30
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


引用回帖:
18楼: Originally posted by sophia-yxh at 2013-12-24 09:33:30
透析复性好的蛋白要上Q柱进行层析的,若加入核酸酶会不会影响蛋白的柱行为呢?

还有目标的pi是4.8,我们用的缓冲液的pH8.0,但在这个条件下,有的时候还是挂不上柱子,这是怎么回事呢?...

不会影响上柱。通常有核酸的样品反而不好。
挂不上柱的原因可能是目标蛋白与其它蛋白/核酸作用形成复合物,影响其带电性。所以我觉得你可以试试用核酸酶作用一下,看看能不能纯化到目标蛋白。
19楼2013-12-24 12:46:14
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zeroon

木虫 (正式写手)



sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
愿李啸领导总工能想出对策来
20楼2014-01-14 22:00:08
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kika8014

金虫 (正式写手)



sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
你好,你的问题,可以明确的说,不是你说的原因。浸粉,或胰蛋白胨中有几种氨基酸是没有,说法不科学,因为不可能,浸粉谷氨酸,丙氨酸等相对含量高点,其它成分比较均衡,胰蛋白胨也差不多,你说有几种氨基酸没有的可能性是,测试方法问题。
21楼2016-01-12 15:03:20
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小花木兰

银虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
高密度发酵大肠杆菌,培养基都是用到蛋白胨和酵母粉的,有不用到吗
22楼2016-01-12 16:26:56
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简单回复
chentao3楼
2013-12-23 12:17   回复  
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
2013-12-23 12:23   回复  
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
xiejf11楼
2013-12-23 12:27   回复  
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
2013-12-23 12:33   回复  
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
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