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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 关于大肠杆菌表达目标蛋白问题
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sophia-yxh

铜虫 (正式写手)

[交流] 关于大肠杆菌表达目标蛋白问题

最近几批的发酵过程中发现，发酵所得的目标蛋白的260的吸光度接近是280时的3倍，可以判定里面几乎全部是核酸，目标蛋白很少了。

后来我查阅资料发现我们添加的tryptone和酵母粉（OXOID)中氨基酸成分有几种是没有的，而恰巧我们目标蛋白中是需要的。我和领导说了这一情况，但是他说大肠杆菌是可以合成各种氨基酸的，不会影响目标蛋白的合成的。我有点疑惑的是，在翻译的时候，由于比较快速而造成大肠杆菌合成这些氨基酸的速度慢，而导致目标蛋白没有合成成功呢？  他说不会的，我的想法是不是很幼稚啊？  而且他一直说发酵没有问题，是纯化和复性的问题。
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1楼 2013-12-23 11:19:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助！ 2014-01-14 23:06:21
会不会是你的目标蛋白结合核酸？你可以试试用核酸酶处理样品后再纯化，看结果如何。
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2楼2013-12-23 11:54:00
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fakebook

木虫 (文坛精英)
★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
愿楼主心想事成
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4楼2013-12-23 12:22:20
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heibi

金虫 (文坛精英)
★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
深深祝福
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5楼2013-12-23 12:22:23
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niu.bi

木虫 (文坛精英)
★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
Good luck
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6楼2013-12-23 12:22:26
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b729

金虫 (文坛精英)
★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
愿楼主心想事成
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7楼2013-12-23 12:23:20
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seeforme

新虫 (知名作家)
★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
Good luck
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8楼2013-12-23 12:23:21
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wendy3

金虫 (文坛精英)
★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
祝福楼主
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10楼2013-12-23 12:24:33
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
本帖仅楼主可见
13楼2013-12-23 14:21:59
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181587941

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
laozuzunzhe: 金币+3, good！ 2014-01-14 23:06:30
你领导说的有一定道理，因为高密度发酵时，很多培养基配方都不含酵母粉和蛋白胨的，表达也很好啊。但是不可否认有些时候加入氨基酸可以提高表达量。具体的要做实验证明的，理论毕竟是理论，谁说了都不一定对，数据说明一切。另外，靠260和280不能说明你的表达情况好坏，应该通过电泳、ELISA等手段，数据才比较有说服力。
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14楼2013-12-23 15:52:01
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sophia-yxh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-23 11:54:00
会不会是你的目标蛋白结合核酸？你可以试试用核酸酶处理样品后再纯化，看结果如何。

是复性好后用核酸酶处理吗？

[ 发自小木虫客户端 ]
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15楼2013-12-24 08:26:25
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sophia-yxh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 181587941 at 2013-12-23 15:52:01
你领导说的有一定道理，因为高密度发酵时，很多培养基配方都不含酵母粉和蛋白胨的，表达也很好啊。但是不可否认有些时候加入氨基酸可以提高表达量。具体的要做实验证明的，理论毕竟是理论，谁说了都不一定对，数据说 ...

电泳条带显示目标蛋白很少，几乎没有，也跑了琼脂糖核酸电泳，也没看到有核酸，奇怪这溶液里面是什么捏？？

[ 发自小木虫客户端 ]
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16楼2013-12-24 08:29:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
15楼: Originally posted by sophia-yxh at 2013-12-24 08:26:25
是复性好后用核酸酶处理吗？
...

任何时候，只要体系大致满足核酸酶的缓冲和离子条件。
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17楼2013-12-24 08:50:10
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sophia-yxh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-24 08:50:10
任何时候，只要体系大致满足核酸酶的缓冲和离子条件。...

透析复性好的蛋白要上Q柱进行层析的，若加入核酸酶会不会影响蛋白的柱行为呢？

还有目标的pi是4.8，我们用的缓冲液的pH8.0，但在这个条件下，有的时候还是挂不上柱子，这是怎么回事呢？
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18楼2013-12-24 09:33:30
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
18楼: Originally posted by sophia-yxh at 2013-12-24 09:33:30
透析复性好的蛋白要上Q柱进行层析的，若加入核酸酶会不会影响蛋白的柱行为呢？

还有目标的pi是4.8，我们用的缓冲液的pH8.0，但在这个条件下，有的时候还是挂不上柱子，这是怎么回事呢？...

不会影响上柱。通常有核酸的样品反而不好。
挂不上柱的原因可能是目标蛋白与其它蛋白/核酸作用形成复合物，影响其带电性。所以我觉得你可以试试用核酸酶作用一下，看看能不能纯化到目标蛋白。
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19楼2013-12-24 12:46:14
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zeroon

木虫 (正式写手)
★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
愿李啸领导总工能想出对策来
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20楼2014-01-14 22:00:08
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kika8014

金虫 (正式写手)
★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
你好，你的问题，可以明确的说，不是你说的原因。浸粉，或胰蛋白胨中有几种氨基酸是没有，说法不科学，因为不可能，浸粉谷氨酸，丙氨酸等相对含量高点，其它成分比较均衡，胰蛋白胨也差不多，你说有几种氨基酸没有的可能性是，测试方法问题。
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21楼2016-01-12 15:03:20
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小花木兰

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
高密度发酵大肠杆菌，培养基都是用到蛋白胨和酵母粉的，有不用到吗
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22楼2016-01-12 16:26:56
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简单回复
chentao3楼
2013-12-23 12:17   回复  
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峰锋风逢烽9楼
2013-12-23 12:23   回复  
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xiejf11楼
2013-12-23 12:27   回复  
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westlife91112楼
2013-12-23 12:33   回复  
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