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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 关于大肠杆菌表达目标蛋白问题
汕头大学海洋科学接受调剂
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sophia-yxh

铜虫 (正式写手)

[交流] 关于大肠杆菌表达目标蛋白问题

最近几批的发酵过程中发现，发酵所得的目标蛋白的260的吸光度接近是280时的3倍，可以判定里面几乎全部是核酸，目标蛋白很少了。

后来我查阅资料发现我们添加的tryptone和酵母粉（OXOID)中氨基酸成分有几种是没有的，而恰巧我们目标蛋白中是需要的。我和领导说了这一情况，但是他说大肠杆菌是可以合成各种氨基酸的，不会影响目标蛋白的合成的。我有点疑惑的是，在翻译的时候，由于比较快速而造成大肠杆菌合成这些氨基酸的速度慢，而导致目标蛋白没有合成成功呢？  他说不会的，我的想法是不是很幼稚啊？  而且他一直说发酵没有问题，是纯化和复性的问题。
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1楼 2013-12-23 11:19:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
18楼: Originally posted by sophia-yxh at 2013-12-24 09:33:30
透析复性好的蛋白要上Q柱进行层析的，若加入核酸酶会不会影响蛋白的柱行为呢？

还有目标的pi是4.8，我们用的缓冲液的pH8.0，但在这个条件下，有的时候还是挂不上柱子，这是怎么回事呢？...

不会影响上柱。通常有核酸的样品反而不好。
挂不上柱的原因可能是目标蛋白与其它蛋白/核酸作用形成复合物，影响其带电性。所以我觉得你可以试试用核酸酶作用一下，看看能不能纯化到目标蛋白。
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19楼2013-12-24 12:46:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助！ 2014-01-14 23:06:21
会不会是你的目标蛋白结合核酸？你可以试试用核酸酶处理样品后再纯化，看结果如何。
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2楼2013-12-23 11:54:00
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181587941

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
sophia-yxh(金币+1): 谢谢参与
laozuzunzhe: 金币+3, good！ 2014-01-14 23:06:30
你领导说的有一定道理，因为高密度发酵时，很多培养基配方都不含酵母粉和蛋白胨的，表达也很好啊。但是不可否认有些时候加入氨基酸可以提高表达量。具体的要做实验证明的，理论毕竟是理论，谁说了都不一定对，数据说明一切。另外，靠260和280不能说明你的表达情况好坏，应该通过电泳、ELISA等手段，数据才比较有说服力。
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14楼2013-12-23 15:52:01
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