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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌超声破碎很久不见澄清仍是白色的
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yuyiqingyang

新虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌超声破碎很久不见澄清仍是白色的

培养重组大肠杆菌（宿主是BL21），载体为PET-32a，目的片段480bp，OD值0.6-0.8时开始进行诱导。37度180转，诱导7h，离心然后破碎功率400w，工作10S，间隔15S，90个循环，菌液便可澄清。但是现在破碎很多个循环仍无效果，破很长时间还是白色的，实验条件都和原来一模一样，不知道哪里出了问题，请高手们帮帮忙啊
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1楼 2012-08-09 14:28:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

healy13

禁虫 (小有名气)
★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-16 13:43:52
本帖内容被屏蔽
2楼2012-08-09 14:35:03
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naturedemon

金虫 (正式写手)
肯定是包涵体，楼上正解
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3楼2012-08-09 15:38:40
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yuyiqingyang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by healy13 at 2012-08-09 14:35:03
37度诱导7h，温度这么高诱导时间又偏长很容易形成包涵体的，形成包涵体后蛋白就很难溶解，需要通过尿素变性来获得你的目的蛋白~可以试下37度诱导4h或15度过夜诱导~

先前能破碎的时候也是同样条件诱导的，200ml的菌液湿重还不到1g，用8mlPBS重悬，破碎可以变澄清，目的蛋白在上清和沉淀中基本上是对半分的。只是不知道为什么现在同样的诱导条件，200ml的菌液用40ml的bindingbuffer重悬，增加破碎时间，溶液总是白色的。怎么判断是包涵体原因还是破碎不完全，显微镜观察吗？
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4楼2012-08-09 17:57:53
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你诱导的条件大多在包涵体里，可以试试低温低IPTG诱导
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在这个纷绕的世俗世界里，能够学会用一颗平常的心去对待周围的一切，也是一种境界。
10楼2012-08-13 13:10:34
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普通回帖

703600973

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by yuyiqingyang at 2012-08-09 17:57:53
先前能破碎的时候也是同样条件诱导的，200ml的菌液湿重还不到1g，用8mlPBS重悬，破碎可以变澄清，目的蛋白在上清和沉淀中基本上是对半分的。只是不知道为什么现在同样的诱导条件，200ml的菌液用40ml的bindingbuffe ...

多破碎一会了，然后离心，把上清和沉淀一起跑个胶看看就知道了。
即便都是包涵体的话也不可能还是白色一点变化都没有的吧。
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5楼2012-08-10 14:56:09
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tiani_tan

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
超声波的探头有没有问题？
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6楼2012-08-10 20:37:12
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yuyiqingyang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by tiani_tan at 2012-08-10 20:37:12
超声波的探头有没有问题？

仪器什么的都没问题
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7楼2012-08-10 23:58:00
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yuyiqingyang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 703600973 at 2012-08-10 14:56:09
多破碎一会了，然后离心，把上清和沉淀一起跑个胶看看就知道了。
即便都是包涵体的话也不可能还是白色一点变化都没有的吧。...

上清和沉淀我都跑过胶了，上清里有很多蛋白条带就是没有我的目的片段，而且所有条带都比较弱不是很浓，沉淀蛋白条带很浓也有目的蛋白。现在无法判断到底是破碎不完全还是所有蛋白都在包涵体里了。循环次数差不多400，再破碎担心蛋白会出问题。
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8楼2012-08-11 00:02:39
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试试低温诱导 看效果如何
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
9楼2012-08-11 14:23:57
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