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yuyiqingyang

新虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌超声破碎很久不见澄清仍是白色的

培养重组大肠杆菌(宿主是BL21),载体为PET-32a,目的片段480bp,OD值0.6-0.8时开始进行诱导。37度180转,诱导7h,离心然后破碎功率400w,工作10S,间隔15S,90个循环,菌液便可澄清。但是现在破碎很多个循环仍无效果,破很长时间还是白色的,实验条件都和原来一模一样,不知道哪里出了问题,请高手们帮帮忙啊
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yuyiqingyang

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 703600973 at 2012-08-10 14:56:09
多破碎一会了,然后离心,把上清和沉淀一起跑个胶看看就知道了。
即便都是包涵体的话也不可能还是白色一点变化都没有的吧。...

上清和沉淀我都跑过胶了,上清里有很多蛋白条带就是没有我的目的片段,而且所有条带都比较弱不是很浓,沉淀蛋白条带很浓也有目的蛋白。现在无法判断到底是破碎不完全还是所有蛋白都在包涵体里了。循环次数差不多400,再破碎担心蛋白会出问题。
8楼2012-08-11 00:02:39
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healy13

禁虫 (小有名气)


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-16 13:43:52
本帖内容被屏蔽

2楼2012-08-09 14:35:03
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naturedemon

金虫 (正式写手)

肯定是包涵体,楼上正解
3楼2012-08-09 15:38:40
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yuyiqingyang

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by healy13 at 2012-08-09 14:35:03
37度诱导7h,温度这么高诱导时间又偏长很容易形成包涵体的,形成包涵体后蛋白就很难溶解,需要通过尿素变性来获得你的目的蛋白~可以试下37度诱导4h或15度过夜诱导~

先前能破碎的时候也是同样条件诱导的,200ml的菌液湿重还不到1g,用8mlPBS重悬,破碎可以变澄清,目的蛋白在上清和沉淀中基本上是对半分的。只是不知道为什么现在同样的诱导条件,200ml的菌液用40ml的bindingbuffer重悬,增加破碎时间,溶液总是白色的。怎么判断是包涵体原因还是破碎不完全,显微镜观察吗?
4楼2012-08-09 17:57:53
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