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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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ds1986080607

新虫 (初入文坛)

[求助] NC膜半干转膜 已有2人参与

本人最近western试验很不顺利,PVDF转膜后marker和泳道都很淡,漂洗之后marker什么的都看不见了,最后显影什么也没有。目的蛋白65KD, 用bio-rad半干转,15V,转膜时间60~90min都试过,估计问题还是出在转膜上,想用NC膜试试,听说NC膜容易转穿,有没有虫友用NC膜做过半干转,交流一下转膜经验啊,
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
半干转移不像湿法,需要滤纸、膜、胶的大小一样,否则转移效率很差。你的15v电流是多少?通常半干转移都是做稳流,根据胶的面积计算电流的。NC膜的条件与PVDF差不多,只是膜比较脆,容易破。

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2楼2013-12-19 15:55:52
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ds1986080607

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-19 15:55:52
半干转移不像湿法,需要滤纸、膜、胶的大小一样,否则转移效率很差。你的15v电流是多少?通常半干转移都是做稳流,根据胶的面积计算电流的。NC膜的条件与PVDF差不多,只是膜比较脆,容易破。

感谢哈,胶膜滤纸都一般大,滤纸是bio-rad的 western paper,比普通的滤纸厚很多(估计要0.3mm多),平时转膜的时候就上下各用一张,普通的滤纸没有用过,电流的话从转膜开始从400MA会一直降到100多,一直在下降,问题会不会出在电流上?
3楼2013-12-20 14:31:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by ds1986080607 at 2013-12-20 14:31:39
感谢哈,胶膜滤纸都一般大,滤纸是bio-rad的 western paper,比普通的滤纸厚很多(估计要0.3mm多),平时转膜的时候就上下各用一张,普通的滤纸没有用过,电流的话从转膜开始从400MA会一直降到100多,一直在下降, ...

做blot本来就是要用3MM的whatman paper。半干转移需要上下各4张滤纸,湿法是上下各一张。转膜时如果用稳压,电流一般会有一些变化,不会这么多。如果不是稳压,电压会逐渐变小,电流也会变小,小的程度比电压多一些。

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4楼2013-12-21 00:50:52
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ds1986080607

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-21 00:50:52
做blot本来就是要用3MM的whatman paper。半干转移需要上下各4张滤纸,湿法是上下各一张。转膜时如果用稳压,电流一般会有一些变化,不会这么多。如果不是稳压,电压会逐渐变小,电流也会变小,小的程度比电压多一些 ...

感谢楼上哈,准备用恒流 面积*2.5ma,转个40min分钟再试试,豁出去了,哈哈哈,
5楼2013-12-22 23:40:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
5楼: Originally posted by ds1986080607 at 2013-12-22 23:40:26
感谢楼上哈,准备用恒流 面积*2.5ma,转个40min分钟再试试,豁出去了,哈哈哈,...

湿法转移一般不考虑胶的面积。因为整个转移体系都是在电场力作用下。只有半干转移才要考虑面积,因为只有三明治区域在电场力的作用之下。
6楼2013-12-23 06:45:27
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日子妞儿

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

15V  23分钟就差不多
我是黑妞儿 哈哈
7楼2014-11-14 14:09:02
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